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Cromatografia idrofoba di interazione (HIC)

La cromatografia idrofoba di interazione (HIC) è una tecnica potente utilizzata per la depurazione delle proteine nelle applicazioni analitiche e preparatorie.

HIC separa e depura le molecole di proteina in base al loro hydrophobicity - è più popolare di altre tecniche della cromatografia per la separazione di proteine poichè impiega un ambiente più di meno denaturante confrontato a loro. Di conseguenza l'attività biologica delle proteine è tenuta intatta.

HIC può anche efficacemente essere usato per eliminare le impurità o le specie aggregate del prodotto nelle soluzioni acquose mentre sfrutta la differenza nei beni idrofobi dei cumuli e delle molecole dell'obiettivo.  È usato spesso congiuntamente alle tecniche quale la cromatografia di cromatografia d'esclusione o di scambio ionico.

Il principio di cromatografia idrofoba di interazione

In HIC, le molecole di proteina del campione sono presentate nella colonna che contiene una soluzione tampone del alto-sale. Il sale promuove l'interazione fra le regioni idrofile ed idrofobe della proteina ed il media diminuendo la solvatazione delle molecole del campione ed esponendo le loro regioni idrofobe.  

La quantità di sale stata necessaria per promuovere legare è inversamente proporzionale al hydrophobicity delle molecole. Quindi le molecole del campione possono essere eluite fuori per il hydrophobicity aumentante facendo uso di un gradiente diminuente del sale. Le molecole di proteina rilegate possono efficacemente essere dissorbite lavando con un buffer o acqua diluito.

I punti in cromatografia idrofoba di interazione

  • I media di HIC sono composti di leganti alchilici o arilici accoppiati ad una matrice inerte e porosa che poi sono imballati in una colonna di cromatografia come disposizione del letto imballato.
  • Una soluzione tampone moderatamente alta del sale è utilizzata per riempire i pori e lo spazio fra le particelle nella matrice. I sali tipici usati sono cloruro del solfato dell'ammonio di 1-2M o di sodio di 3M che sono selezionati per promuovere l'interazione chiave fra il campione della proteina ed il media mentre minimizzando che di altre proteine meno idrofobe (impurità).
  • La colonna è lavata per eliminare alle le proteine dirette non.
  • La concentrazione nel sale è abbassata gradualmente per cominciare eluire le proteine. La manipolazione dei gradienti del sale permette l'eluizione differenziale delle proteine - le proteine che hanno il hydrophobicity più basso sono eluite in primo luogo.
  • Un lavaggio definitivo facendo uso delle guide senza sale del buffer elimina alle le proteine dirette a stretta. Gli additivi nel buffer possono più ulteriormente promuovere il dissorbimento delle proteine rilegate. Gli additivi possono includere gli alcool miscibili in acqua, (` del ` salare-in'') soluzioni saline chaotropic e detersivi.
  • Raramente, i termini più duri quale l'idrossido di sodio di 0.5-1.0M, l'etanolo di 70%, o l'isopropanolo di 30% sono richiesti per eliminare tutte le proteine rilegate.

Fattori cruciali che pregiudicano le interazioni idrofobe

Legante - il tipo di legante usato determina il comportamento dell'adsorbimento della catena che diritta delle proteine per esempio i leganti alchilici è idrofobi mentre i leganti arilici mostrano sia le interazioni aromatiche che idrofobe.

Matrice - i carboidrati idrofili quali i materiali uniti con legami atomici incrociati del copolimero del sintetico e dell'agarosi sono i supporti più comunemente usati. I supporti differenti varieranno nella loro selettività anche con lo stesso legante.

Grado di sostituzione - la capacità obbligatoria di una proteina è direttamente proporzionale al grado di sostituzione del legante. Tuttavia, gli alti livelli della sostituzione del legante aumentano la resistenza dell'interazione e la rendono difficile eluire le proteine.

Temperatura - c'è una correlazione diretta e positiva fra temperato e l'affinità delle interazioni idrofobe. La temperatura elevata egualmente influenza la struttura e la solubilità delle proteine. La temperatura è usata raramente per modulare l'eluizione delle molecole in HIC.

pH - Le fasi mobili utilizzate in HIC principalmente hanno un intervallo neutrale di pH di 5 - 7. L'effetto di pH sulle interazioni di proteina-media varia da proteina a proteina. Generalmente, l'interazione idrofoba fra i media e la proteina diminuisce con aumento nel pH mentre la tassa della proteina tende ad aumentare. Mentre il pH può avere un effetto sul grado di associazione della proteina, non è considerato abbastanza significativo di usare i gradienti di pH per l'eluizione delle molecole del soluto.

Concentrazione nel sale - sali l'aggiunta al buffer ed il campione promuove l'associazione della legante-proteina ma c'è un rischio di precipitazione della proteina alle alte concentrazioni nel sale. Il sodio, l'ammonio, o i solfati del potassio sono conosciuti per produrre gli più alti effetti della precipitazione sebbene siano molto efficaci nella promozione dell'interazione fra il legante e la proteina.

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Last Updated: Apr 12, 2019

Susha Cheriyedath

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Susha Cheriyedath

Susha has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Chemistry and Master of Science (M.Sc) degree in Biochemistry from the University of Calicut, India. She always had a keen interest in medical and health science. As part of her masters degree, she specialized in Biochemistry, with an emphasis on Microbiology, Physiology, Biotechnology, and Nutrition. In her spare time, she loves to cook up a storm in the kitchen with her super-messy baking experiments.

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