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Une synthèse de l'immunofluorescence

L'immunofluorescence est une technique basée sur microscope hautement puissante qui est employée dans la recherche préclinique et les réglages cliniques pour trouver la présence des molécules d'objectif spécifique.

ImmunofluorescenceCrédit d'image : DrimaFilm/Shutterstock.com

Comment l'immunofluorescence fonctionne-t-elle ?

N'importe quel type de technique (IF) d'immunofluorescence exigera l'utilisation d'un anticorps fluorescent-marqué qui est employé pour recenser et les protéines localisées, les antigènes, ou d'autres molécules biologiques actuelles en dedans ou à l'extérieur de la cellule. L'interaction entre ces anticorps purifiés, qui peuvent être monoclonaux ou polyclonaux, comporte le grippement non-covalent des déterminants antigéniques.

Pour concevoir la liaison des anticorps à leurs antigènes respectifs, un fluorochrome spécifique, autrement connu comme teinture fluorescente, avec les crêtes distinctes de longueur d'onde d'excitation et d'émission est sélecté a basé sur la molécule-cible. La représentation d'immunofluorescence de l'acide désoxyribonucléique (ADN), par exemple, utilisera type 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), qui grippe à aux régions riches de la double helice d'ADN.

Types de techniques d'immunofluorescence

Il y a quatre types importants de techniques d'immunofluorescence, dont comprenez direct SI, indirect SI, indirect SI la fixation du complément (IF-CF), et le double SI.  

Dirigez l'immunofluorescence

Par définition, dirigez SI est une procédure la souillure histologique en pas à pas qui tient compte de la visualisation d'un anticorps in vivo fluorescent-marqué unique qui a été dirigé contre un antigène d'objectif d'intérêt. Un typique dirigent SI le protocole pour les parties gelées de tissu commencera par rincer les parties dans PBS et suivra avec l'incubation des parties avec des anticorps fluorescent-étiquetés qui sont dirigés contre l'antigène d'objectif.

Type, les anticorps utilisés dans direct SI aura des spécificités contre l'IgG, l'IgM, l'IgA, le complément 3 (C3), et la fibrine. Notamment, la concentration de chaque anticorps est déterminée par les expériences précédentes qui ont confirmé le rapport de signe-à-mouvement propre le plus élevé.

Après incubation, des guides sont de nouveau lavés et alors montés pour tenir compte de la représentation avec un microscope de fluorescence. Certains des avantages de direct SI comprenez la spécificité élevée et les conditions en temps inférieures ; cependant, le nombre limité d'anticorps qui sont procurables pour gripper aux objectifs spécifiques peut limiter la sensibilité de cette technique pour certaines applications.

Immunofluorescence indirecte

Par rapport à la technique en une étape pour direct SI, indirecte SI utilise une technique en deux étapes. Plutôt qu'utilisant un anticorps fluorescent-marqué unique, indirect S'incube l'échantillon avec de l'anticorps primaire non étiqueté, qui est suivi d'incubation avec de l'anticorps secondaire fluorophore-marqué qui est dirigé contre la partie de Fc de l'anticorps primaire.

Bien qu'indirect SI est plus long, on le considère beaucoup plus de technique sensible par rapport à direct SI puisque des anticorps secondaires multiples peuvent être employés pour gripper à chaque anticorps primaire, par conséquent amplifiant le signe potentiel de fluorescence.

Bien qu'indirect SI est associé à certains avantages en termes de sensibilité accrue et souplesse d'employer différents anticorps secondaires conjugués, cette technique peut également être plus complexe, en particulier pendant des expériences multiplex concernant plusieurs anticorps secondaires des espèces différentes d'objectif.

IF-CF indirect

Un troisième type de technique d'immunofluorescence est IF-CF indirect. Le principe de base de fonctionnement derrière IF-CF indirect est que l'interaction obligatoire entre les anticorps et leurs antigènes visés produira de beaucoup de molécules C3. Par rapport à indirect SI seul, IF-CF indirect est considéré une technique beaucoup plus sensible d'amplification.

Double immunofluorescence

Le quatrième et final type de SI la technique comprend le double SI. Une fois utilisé pour des expériences in vitro, double SI tient compte de l'identification et du marquage de deux antigènes différents actuels sur une cellule.

Comparativement, expérimente in vivo utilisant cette technique d'imagerie dans ou des êtres humains ou les modèles animaux peuvent recenser deux anticorps qui ont été marqués avec différents fluorophores.

Bien que double SI peut être employé comme méthode directe ou indirecte, la méthode indirecte pour le double SI est considéré plus sensible par rapport à quand la méthode directe est utilisée.

Limitations de l'immunofluorescence

L'immunofluorescence est une technique d'imagerie incroyablement puissante qui peut être employée pour le diagnostic d'un large éventail de pathologies. Tandis que ceci peut être vrai, plusieurs différents facteurs peuvent déterminer la qualité et l'installation de l'S'image. La qualité et la concentration de l'anticorps primaire et secondaire doivent être soigneusement déterminées et vérifiées pour s'assurer qu'un rapport élevé de signe-à-mouvement propre est réalisé.

SI l'image qui montre le grippement non spécifique extrême, par exemple, pourrait être attribuée à un anticorps de mauvaise qualité, tel qu'un qui est expiré ou non spécifique à l'antigène d'intérêt.

Une autre raison de cette augmentation de la souillure pourrait être une forte concentration de l'anticorps qui a été employé pendant l'incubation, qui peut empêcher la localisation précise des complexes immuns de se produire.

En plus des défis de dilution, la manipulation incorrecte des échantillons peut également nuire la souillure précise. Tous SI des échantillons doivent être maintenus dans l'obscurité si non utilisables, car l'exposition accrue à la lumière peut entraîner le blanchiment du signe, qui est défini pendant qu'une réduction du signe mesurable des sondes fluorescentes.

Références

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Last Updated: Mar 18, 2021

Benedette Cuffari

Written by

Benedette Cuffari

After completing her Bachelor of Science in Toxicology with two minors in Spanish and Chemistry in 2016, Benedette continued her studies to complete her Master of Science in Toxicology in May of 2018. During graduate school, Benedette investigated the dermatotoxicity of mechlorethamine and bendamustine; two nitrogen mustard alkylating agents that are used in anticancer therapy.

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