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Una generalità di immunofluorescenza

L'immunofluorescenza è ad una tecnica basata a microscopio altamente potente che è utilizzata sia nella ricerca preclinica che nelle impostazioni cliniche per individuare la presenza di molecole specifiche dell'obiettivo.

ImmunofluorescenzaCredito di immagine: DrimaFilm/Shutterstock.com

Come l'immunofluorescenza funziona?

Qualunque tipo di tecnica (IF) dell'immunofluorescenza richiederà l'uso di un anticorpo fluorescente-contrassegnato che è usato per identificare e proteine individuate, antigeni, o altre molecole biologiche presenti dentro o fuori della cella. L'interazione fra questi anticorpi depurativi, che possono essere monoclonali o policlonali, comprende l'associazione non covalente dei fattori determinanti antigenici.

Per visualizzare il legame degli anticorpi ai loro rispettivi antigeni, un fluorocromo specificato, altrimenti conosciuto come tintura fluorescente, con i picchi distinti di lunghezza d'onda dell'emissione e di eccitazione è selezionato in base alla molecola dell'obiettivo. La rappresentazione dell'immunofluorescenza di acido desossiribonucleico (DNA), per esempio, utilizzerà tipicamente 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), che lega alle regioni ricche di doppia elica del DNA.

Tipi di tecniche di immunofluorescenza

Ci sono quattro tipi importanti di tecniche dell'immunofluorescenza, di cui includa diretto SE, indiretti SE, indiretto SE complemento-fissazione (IF-CF) e doppio SE.  

Diriga l'immunofluorescenza

Per definizione, diriga SE è una procedura macchiare istologica a passo singolo che tiene conto la visualizzazione di singolo anticorpo in vivo fluorescente-contrassegnato che è stato diretto contro un antigene dell'obiettivo di interesse. Un tipico dirige SE il protocollo per le sezioni congelate del tessuto comincerà con risciacquare le sezioni in PBS e seguirà con incubazione delle sezioni con gli anticorpi fluorescente-etichettati che sono diretti contro l'antigene dell'obiettivo.

Tipicamente, gli anticorpi utilizzati in diretto SE avrà specificità contro IgG, IgM, IgA, il complemento 3 (C3) e la fibrina. Considerevolmente, la concentrazione di ogni anticorpo è determinata dagli esperimenti precedenti che hanno confermato il più alto rapporto di segnale--sfondo.

A seguito di incubazione, le diapositive sono lavate di nuovo e poi sono montate per tenere conto la rappresentazione con un microscopio di fluorescenza. Alcuni dei vantaggi di diretto SE comprenda l'alta specificità ed i requisiti di in tempo bassi; tuttavia, il numero limitato degli anticorpi che sono a disposizione per legare agli obiettivi specifici può limitare la sensibilità di questa tecnica per determinate applicazioni.

Immunofluorescenza indiretta

Rispetto alla tecnica una tappa per diretto SE, indiretta SE utilizza una tecnica in due tappe. Piuttosto che utilizzando un singolo anticorpo fluorescente-contrassegnato, indiretto SE incuba il campione con un anticorpo primario adenoide, che è seguito da incubazione con un anticorpo secondario fluorophore-contrassegnato che è diretto contro la parte di Fc dell'anticorpo primario.

Sebbene indiretto SE è più che richiede tempo, sia considerato come una tecnica molto più sensibile rispetto a diretto SE poiché gli anticorpi secondari multipli possono essere usati per legare ad ogni anticorpo primario, quindi ampliando il segnale potenziale della fluorescenza.

Sebbene indiretto SE è associato con determinati vantaggi in termini di sensibilità e flessibilità aumentate usare gli anticorpi secondari coniugati differenti, questa tecnica possa anche essere più complessa, specialmente durante gli esperimenti multipli che comprendono parecchi anticorpi secondari delle specie differenti dell'obiettivo.

IF-CF indiretto

Un terzo tipo di tecnica dell'immunofluorescenza è IF-CF indiretto. Il principio fondamentale di funzionamento dietro IF-CF indiretto è che l'interazione obbligatoria fra gli anticorpi ed i loro antigeni mirati a genererà molte molecole C3. Rispetto ad indiretto SE solo, IF-CF indiretto è considerato come una tecnica molto più sensibile di amplificazione.

Doppia immunofluorescenza

Il quarto e tipo definitivo di SE la tecnica comprende il doppio SE. Una volta usato per gli esperimenti in vitro, doppio SE tiene conto l'identificazione ed il contrassegno di due antigeni differenti presenti su una cella.

Comparativamente, in vivo sperimenta utilizzando questa tecnica di rappresentazione o in esseri umani o i modelli dell'animale possono identificare due anticorpi che sono stati contrassegnati con differenti fluorophores.

Sebbene doppio SE può essere usato come metodo diretto o indiretto, il metodo indiretto per il doppio SE è considerato come sensibilmente più sensibile rispetto a quando il metodo diretto è impiegato.

Limitazioni di immunofluorescenza

L'immunofluorescenza è una tecnica di rappresentazione incredibilmente potente che può essere usata per la diagnosi di una vasta gamma di patologie. Mentre questo può essere vero, vari fattori possono determinare la qualità e l'utilità dell'SE immagine. La qualità e la concentrazione sia dell'anticorpo primario che secondario devono essere con attenzione risolute e provate per assicurarsi che un alto rapporto di segnale--sfondo sia raggiunto.

SE l'immagine che mostra l'associazione non specifica estrema, per esempio, potesse essere attribuita ad un anticorpo di cattiva qualità, come uno che è scaduto o non specifico all'antigene di interesse.

Un'altra ragione per questo aumento nella macchiatura potrebbe essere un'alta concentrazione dell'anticorpo che è stato usato durante l'incubazione, che può impedire la localizzazione accurata dei complessi immuni accadere.

Oltre alle sfide di diluizione, la manipolazione impropria dei campioni può anche interferire con la macchiatura accurata. Tutti SE i campioni devono essere tenuti nello scuro una volta non in uso, poichè l'esposizione aumentata ad indicatore luminoso può causare l'imbianchimento del segnale, che è definito mentre una riduzione del segnale misurabile dalle sonde fluorescenti.

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Last Updated: Mar 18, 2021

Benedette Cuffari

Written by

Benedette Cuffari

After completing her Bachelor of Science in Toxicology with two minors in Spanish and Chemistry in 2016, Benedette continued her studies to complete her Master of Science in Toxicology in May of 2018. During graduate school, Benedette investigated the dermatotoxicity of mechlorethamine and bendamustine; two nitrogen mustard alkylating agents that are used in anticancer therapy.

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