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Uma vista geral da imunofluorescência

A imunofluorescência é uma técnica microscópio-baseada altamente poderosa que seja usada na pesquisa pré-clínica e em ajustes clínicos para detectar a presença de moléculas específicas do alvo.

ImunofluorescênciaCrédito de imagem: DrimaFilm/Shutterstock.com

Como a imunofluorescência trabalha?

Qualquer tipo de técnica (IF) da imunofluorescência exigirá o uso de um anticorpo fluorescente-etiquetado que seja usado para identificar dentro ou fora e proteínas encontradas, antígenos, ou outras moléculas biológicas actuais da pilha. A interacção entre estes anticorpos refinados, que podem ser monoclonais ou polyclonal, envolve o emperramento não-covalent das causas determinantes antigénicas.

Para visualizar o emperramento dos anticorpos a seus antígenos respectivos, um fluorochrome especificado, se não sabido como uma tintura fluorescente, com picos distintos do comprimento de onda da excitação e da emissão é seleccionado com base na molécula do alvo. A imagem lactente da imunofluorescência do ácido deoxyribonucleic (ADN), por exemplo, utilizará tipicamente 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), que liga nas regiões ricas da hélice dobro do ADN.

Tipos de técnicas da imunofluorescência

Há quatro tipos principais de técnicas da imunofluorescência, de que inclua directo SE, indirecto SE, indirecto SE a complemento-fixação (IF-CF), e o dobro SE.  

Dirija a imunofluorescência

Por definição, dirija SE é um procedimento manchar histológico de uma etapa que permita o visualização de um único anticorpo in vivo fluorescente-etiquetado que seja dirigido contra um antígeno do alvo do interesse. Um típico dirige SE o protocolo para secções congeladas do tecido começará com a enxaguadela das secções em PBS e seguirá com a incubação das secções com anticorpos fluorescente-etiquetados que são dirigidos contra o antígeno do alvo.

Tipicamente, os anticorpos usados em directo SE terá especificidades contra IgG, IgM, IgA, complemento 3 (C3), e fibrina. Notàvel, a concentração de cada anticorpo é determinada pelas experiências precedentes que confirmaram a relação a mais alta do sinal-à-fundo.

Depois da incubação, as corrediças são lavadas outra vez e montadas então para permitir a imagem lactente com um microscópio de fluorescência. Algumas das vantagens de directo SE inclua a especificidade alta e baixas exigências do tempo; contudo, o número limitado de anticorpos que estão disponíveis para ligar aos alvos específicos pode limitar a sensibilidade de aplicações desta técnica com certeza.

Imunofluorescência indirecta

Em relação à técnica de uma etapa para directo SE, indirecta SE utiliza uma técnica do pas-de-deux. Um pouco do que utilizando um único anticorpo fluorescente-etiquetado, indirecto SE incuba a amostra com um anticorpo preliminar sem etiqueta, que esteja seguido pela incubação com um anticorpo secundário fluoróforo-etiquetado que seja dirigido contra a parcela de Fc do anticorpo preliminar.

Embora indirecto SE é mais demorado, considera-se ser uma técnica muito mais sensível em relação a directo SE desde que os anticorpos secundários múltiplos podem ser usados para ligar a cada anticorpo preliminar, daqui amplificando o sinal potencial da fluorescência.

Embora indirecto SE é associado com determinadas vantagens em termos da sensibilidade e da flexibilidade aumentadas usar anticorpos secundários conjugados diferentes, esta técnica pode igualmente ser mais complexa, particularmente durante as experiências multiplex que envolvem diversos anticorpos secundários de espécies diferentes do alvo.

IF-CF indirecto

Um terceiro tipo de técnica da imunofluorescência é IF-CF indirecto. O princípio de funcionamento básico atrás de IF-CF indirecto é que a interacção obrigatória entre anticorpos e seus antígenos visados gerará muitas moléculas C3. Em relação a indirecto SE sozinho, IF-CF indirecto é considerado ser uma técnica muito mais sensível da amplificação.

Imunofluorescência dobro

O quarto e tipo final de SE a técnica inclui o dobro SE. Quando usado para in vitro experiências, dobro SE permite a identificação e a rotulagem de dois antígenos diferentes actuais em uma pilha.

Comparativamente, experimenta in vivo utilizando esta técnica de imagem lactente ou em seres humanos ou os modelos do animal podem identificar dois anticorpos que foram etiquetados com fluorophores diferentes.

Embora dobro SE pode ser usado como um método directo ou indirecto, o método indirecto para o dobro SE está considerado para ser significativamente mais sensível em relação a quando o método directo estiver empregado.

Limitações da imunofluorescência

A imunofluorescência é uma técnica de imagem lactente incredibly poderosa que possa ser usada para o diagnóstico de uma vasta gama de patologias. Quando isto puder ser verdadeiro, diversos factores diferentes podem determinar a qualidade e o serviço público do SE imagem. A qualidade e a concentração do anticorpo preliminar e secundário devem ser com cuidado determinadas e testadas para assegurar-se de que uma relação alta do sinal-à-fundo esteja conseguida.

SE a imagem que mostra o emperramento não específico extremo, por exemplo, poderia ser atribuída a um anticorpo de má qualidade, tal como um que é expirado ou nao específico ao antígeno do interesse.

Uma outra razão para este aumento na mancha poderia ser uma concentração alta do anticorpo que foi usado durante a incubação, que pode impedir que a localização exacta dos complexos imunes ocorra.

Além do que desafios da diluição, a manipulação imprópria das amostras pode igualmente interferir com a mancha exacta. Tudo SE as amostras deverem ser mantidas na obscuridade quando não no uso, como a exposição aumentada à luz podem causar o descoramento do sinal, que está definido enquanto uma redução no sinal mensurável das pontas de prova fluorescentes.

Referências

Further Reading

Last Updated: Mar 18, 2021

Benedette Cuffari

Written by

Benedette Cuffari

After completing her Bachelor of Science in Toxicology with two minors in Spanish and Chemistry in 2016, Benedette continued her studies to complete her Master of Science in Toxicology in May of 2018. During graduate school, Benedette investigated the dermatotoxicity of mechlorethamine and bendamustine; two nitrogen mustard alkylating agents that are used in anticancer therapy.

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