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Una reseña de la inmunofluorescencia

La inmunofluorescencia es una técnica microscopio-basada altamente potente que se utiliza en la investigación preclínica y fijaciones clínicas para descubrir la presencia de moléculas específicas del objetivo.

InmunofluorescenciaHaber de imagen: DrimaFilm/Shutterstock.com

¿Cómo la inmunofluorescencia trabaja?

Cualquier tipo de técnica (IF) de la inmunofluorescencia requerirá el uso de un anticuerpo fluorescente-etiqueta que se utilice para determinar y las proteínas localizadas, los antígenos, u otras moléculas biológicas presentes dentro o fuera de la célula. La acción recíproca entre estos anticuerpos purificados, que pueden ser monoclonales o policlonales, implica el atascamiento no-covalente de los determinantes antigénicos.

Para visualizar el atascamiento de los anticuerpos a sus antígenos respectivos, un fluorocromo especificado, si no conocido como tinte fluorescente, con los picos distintos de la longitud de onda de la excitación y de la emisión se selecciona sobre la base de la molécula del objetivo. La proyección de imagen de la inmunofluorescencia del ácido desoxirribonucléico (DNA), por ejemplo, utilizará típicamente 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), que ata EN a las regiones ricas del doble hélice de la DNA.

Tipos de técnicas de la inmunofluorescencia

Hay cuatro tipos importantes de técnicas de la inmunofluorescencia, cuyo incluya directo SI, indirecto SI, indirecto SI la complemento-fijación (IF-CF), y doble SI.  

Dirija la inmunofluorescencia

Por definición, dirija SI es un procedimiento la coloración histológico de un solo paso que permite la visualización de un único anticuerpo in vivo fluorescente-etiqueta que se ha dirigido contra un antígeno del objetivo del interés. Un típico dirige SI el protocolo para las secciones congeladas del tejido comienza con enjuagar las secciones en PBS y sigue con la incubación de las secciones con los anticuerpos fluorescente-marcados con etiqueta que se dirigen contra el antígeno del objetivo.

Típicamente, los anticuerpos usados en directo SI tiene especificidades contra IgG, IgM, IgA, el complemento 3 (C3), y la fibrina. Notablemente, la concentración de cada anticuerpo es determinada por los experimentos anteriores que han confirmado la índice más alta del señal-a-fondo.

Después de la incubación, las diapositivas se lavan otra vez y después se montan para permitir proyección de imagen con un microscopio de fluorescencia. Algunas de las ventajas de directo SI incluya la alta especificidad y los requisitos inferiores del tiempo; sin embargo, el número limitado de anticuerpos que estén disponibles para atar a los objetivos específicos puede limitar la sensibilidad de los usos de esta técnica con certeza.

Inmunofluorescencia indirecta

Con respecto a la técnica de un solo paso para directo SI, indirecta SI utiliza una técnica de dos etapas. Bastante que utilizando un único anticuerpo fluorescente-etiqueta, indirecto SI incuba la muestra con un anticuerpo primario sin etiqueta, que es seguido por la incubación con un anticuerpo secundario fluoróforo-etiqueta que se dirija contra la porción de Fc del anticuerpo primario.

Aunque sea indirecto SI es más que toma tiempo, se considere ser una técnica mucho más sensible con respecto a directo SI puesto que los anticuerpos secundarios múltiples se pueden utilizar para atar a cada anticuerpo primario, por lo tanto amplificando la señal potencial de la fluorescencia.

Aunque sea indirecto SI se asocia a ciertas ventajas en términos de sensibilidad y adaptabilidad crecientes de utilizar diversos anticuerpos secundarios conjugados, esta técnica pueda también ser más compleja, determinado durante los experimentos múltiplexes que implican varios anticuerpos secundarios de diversas especies del objetivo.

IF-CF indirecto

Un tercer tipo de técnica de la inmunofluorescencia es IF-CF indirecto. El principio de funcionamiento básico detrás de IF-CF indirecto es que la acción recíproca obligatoria entre los anticuerpos y sus antígenos apuntados generará muchas moléculas C3. Con respecto a indirecto SI es solo, IF-CF indirecto se considera ser una técnica mucho más sensible de la amplificación.

Inmunofluorescencia doble

El cuarto y final tipo de SI la técnica incluye el doble SI. Cuando está utilizado para los experimentos ines vitro, doble SI tiene en cuenta la identificación y la etiqueta de dos diversos antígenos presentes en una célula.

Comparativamente, in vivo experimenta utilizando esta técnica de proyección de imagen en o seres humanos o los modelos del animal pueden determinar dos anticuerpos que han etiqueta con diversos fluorophores.

Aunque doble SI puede ser utilizado como método directo o indirecto, el método indirecto para el doble SI se considera para ser más sensible con respecto a cuando se emplea el método directo.

Limitaciones de la inmunofluorescencia

La inmunofluorescencia es una técnica de proyección de imagen increíblemente potente que se puede utilizar para la diagnosis de una amplia gama de patologías. Mientras que esto puede ser verdad, varios diversos factores pueden determinar la calidad y la utilidad del SI imagen. La calidad y la concentración del anticuerpo primario y secundario deben ser cuidadosamente resueltas y probadas para asegurarse de que una alta índice del señal-a-fondo está lograda.

SI la imagen que muestra el atascamiento no específico extremo, por ejemplo, se podría atribuir a un anticuerpo de mala calidad, tal como uno se expira que o no específico al antígeno del interés.

Otra razón de este aumento en la coloración podría ser una alta concentración del anticuerpo que fue utilizado durante la incubación, que puede evitar que ocurra la localización exacta de los complejos inmunes.

Además de retos de la dilución, el manejo incorrecto de muestras puede también interferir con la coloración exacta. Todos SI las muestras se deben mantener la oscuridad cuando son paradas, pues la exposición creciente a la luz puede causar el blanqueo de la señal, se define que mientras que una reducción en la señal mensurable de las antenas fluorescentes.

Referencias

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Last Updated: Mar 18, 2021

Benedette Cuffari

Written by

Benedette Cuffari

After completing her Bachelor of Science in Toxicology with two minors in Spanish and Chemistry in 2016, Benedette continued her studies to complete her Master of Science in Toxicology in May of 2018. During graduate school, Benedette investigated the dermatotoxicity of mechlorethamine and bendamustine; two nitrogen mustard alkylating agents that are used in anticancer therapy.

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