Miglioramento dell'affinità dell'anticorpo facendo uso di CRISPR

I campioni di sangue umani possono essere usati per produrre gli anticorpi contro un antigene di interesse. Poiché il sangue contiene la antigene-presentazione delle celle immuni, l'identificazione dell'anticorpo richiede soltanto un'analisi obbligatoria di identificare le celle che presentano gli anticorpi adatti.

Tuttavia, questo seleziona per gli anticorpi “in anticipo„, che nell'organismo subirebbero la maturazione dai giri multipli della mutazione e della selezione, piombo agli anticorpi che sono più efficaci in antigene-associazione. Il lavoro dai ricercatori francesi suggerisce che un sistema di CRISPR possa essere usato per determinare un trattamento di maturazione equivalente in vitro.

Questa ricerca è stata pubblicata in biotecnologia del giornale BMC.

Cella non Xeros circostante degli anticorpi dopo maturazioneCredito di immagine: Design_Cells/Shutterstock.com

Maturazione dell'anticorpo in vivo

Promessa della tenuta degli anticorpi grande come agenti terapeutici ed infatti, sono già in uso per il trattamento di varie malattie. Come grande funzionalità, gli anticorpi per gli antigeni specifici possono essere isolati dai donatori umani. Per esempio, il sistema immunitario di una persona che precedentemente è stata esposta ad un antigene (per esempio da un'infezione virale o batterica, o una vaccinazione) tenterà di identificare un efficace anticorpo che neutralizza l'antigene.

Una volta che un anticorpo adatto è trovato, subisce i cicli di maturazione attraverso cui la sequenza dell'anticorpo sarà ottimizzata per aumentare la sua efficacia in associazione dell'antigene. Gli anticorpi risultanti possono essere identificati sperimentalmente dai campioni di sangue dalle analisi obbligatorie dell'antigene e se riuscito l'anticorpo può essere prodotto biotecnologicamente mediante tecniche stabilite.

Per evitare che un soggetto umano deve essere esposto ad un antigene, l'anticorpo-identificazione può anche essere effettuata nelle colture cellulari. In particolare, antigene-presentare le celle immuni (linfociti B) può essere isolata dai campioni di sangue umani e dalla loro antigene-specificità può essere valutata in vitro, per esempio contrassegnando gli antigeni con le tinture fluorescenti ed identificando quali celle diventano fluorescenti.

In questo caso, i cicli di maturazione dell'antigene dovranno essere effettuati in vitro anche. La ricerca precedente ha contato sulla costruzione delle librerie mutanti del grande anticorpo con le mutazioni casuali, che estesa selezione tuttavia richiesta per identificare i mutanti dell'anticorpo che avevano conservato la antigene-specificità ma erano migliorato la resistenza dell'antigene-associazione.

In questo caso studi, ricercatori francesi piombo dai professor Richard Breathnach e Xavier Saulquin (Nantes) ha dimostrato che un approccio basato CRISPR-X può essere usato in vitro per indurre le mutazioni ai siti specifici di un gene dell'anticorpo, miglioranti la sua resistenza dell'antigene-associazione senza compromettere sulla specificità dell'antigene.

a finestre controllate CRISPR di mutazione

Gli scienziati hanno usato le donazioni di sangue umano del modulo delle cellule immuni per sviluppare un anticorpo contro un antigene di esempio. Per ulteriori studi, hanno selezionato un anticorpo che non era eccessivamente forte nel legare l'antigene. Dopo isolamento del anticorpo-gene, hanno usato gli approcci genetici a transfect una linea cellulare umana per produrre l'anticorpo.

Le mutazioni sono state introdotte nel gene dell'anticorpo usando CRISPR-X. Il gene convenzionale di CRISPR che modifica il sistema comprende un RNA della guida (gRNA) per l'identificazione di una sequenza del DNA dell'obiettivo e un enzima associato Cas9 che fende il DNA al sito riconosciuto dal gRNA.

Con CRISP-X, tuttavia, una variante “morta„ Cas9 è usata che lega soltanto a gRNA ha riconosciuto il sito e recluta gli enzimi supplementari che sono capaci di introdurre le mutazioni del DNA nel circondare della sede del legame. Facendo uso di questa tecnica, i ricercatori hanno generato le varianti dell'anticorpo che sono state subite una mutazione soltanto in determinate regioni del gene, eppure permettere la considerevole variabilità per modificare del gene.

In vitro “la maturazione„ aumenta la resistenza obbligatoria

Con soltanto due cicli della mutazione e della selezione, gli scienziati potevano a maturate il loro anticorpo originale in una versione con più forte resistenza dell'antigene-associazione di 80 volte. Poiché avevano effettuato la procedura nelle colture cellulari in vitro, questi cicli di due mutazioni hanno richiesto soltanto sei settimane di tempo.

Forse la più grande opportunità di questo metodo di generazione dell'anticorpo si trova nel fatto che la sequenza originale dell'anticorpo ha uscito dal sistema immunitario di un donatore umano, mentre la maturazione ha fatto non richiesto l'organismo umano.

Per molti sviluppi dell'anticorpo, gli antigeni sono iniettati negli animali (per esempio mouse) per utilizzare il loro sistema immunitario per l'identificazione dell'anticorpo. Il rischio è che una volta iniettato negli esseri umani, l'anticorpo animale-derivato somiglierà ad un antigene non Xeros e sarà attaccato dal sistema immunitario umano. Cominciare fuori dalle celle immuni umane e maturating gli anticorpi in vitro possono quindi migliorare la sicurezza degli anticorpi per uso terapeutico.

Conflitti di interessi

Gli autori di studio dichiarano in loro pubblicazione che la campionatura del sangue dai soggetti umani era stata approvata dal comitato di etica locale CPP grande Ouest IV (numero di riferimento: MESR DC-2017-2987).

Sorgente

Devilder MC et al., ex vivo evoluzione degli anticorpi umani da CRISPR-X: da un repertorio ingenuo del linfocita B ad affinità ha maturato gli anticorpi. Biotecnologia 2019, 19, articolo numero 14 di BMC; DOI: 10.1186/s12896-019-0504-z.

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Last Updated: Oct 16, 2019

Christian Zerfaß, Ph.D.

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Christian Zerfaß, Ph.D.

Christian is an enthusiastic life scientist who wants to understand the world around us. He was awarded a Ph.D. in Protein Biochemistry from Johannes Gutenberg University in Mainz, Germany, in 2015, after which he moved to Warwick University in the UK to become a post-doctoral researcher in Synthetic Biology.

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