Melhorando a afinidade do anticorpo usando CRISPR

As amostras de sangue humano podem ser usadas para produzir anticorpos contra um antígeno do interesse. Desde que o sangue contem a antígeno-apresentação de pilhas imunes, a identificação do anticorpo exige somente um ensaio obrigatório identificar as pilhas que apresentam anticorpos apropriados.

Contudo, isto selecciona para os anticorpos “adiantados”, que no organismo se submeteriam à maturação por círculos múltiplos da mutação e da selecção, conduzindo aos anticorpos que são mais eficazes na antígeno-ligação. O trabalho por pesquisadores franceses sugere que um sistema de CRISPR possa ser usado para conduzir in vitro um processo de maturação equivalente.

Esta pesquisa foi publicada na biotecnologia do jornal BMC.

Pilha estrangeira circunvizinha dos anticorpos após a maturaçãoCrédito de imagem: Design_Cells/Shutterstock.com

Maturação do anticorpo in vivo

Os anticorpos mantêm a grande promessa porque terapêutico agentes, e de facto, são já dentro uso para o tratamento de uma variedade de doenças. Como uma grande característica, os anticorpos para antígenos específicos podem ser isolados dos doadores humanos. Por exemplo, o sistema imunitário de uma pessoa que seja expor previamente a um antígeno (por exemplo de uma infecção viral ou bacteriana, ou uma vacinação) tentará identificar um anticorpo eficaz que neutralize o antígeno.

Uma vez que um anticorpo apropriado é encontrado, submete-se aos ciclos da maturação através de que a seqüência do anticorpo será aperfeiçoada para aumentar sua eficácia no emperramento do antígeno. Os anticorpos resultantes podem experimental ser identificados das amostras de sangue por ensaios obrigatórios do antígeno, e se bem sucedido o anticorpo pode ser produzido biotecnològica por técnicas estabelecidas.

Para evitar que um assunto humano tenha que ser expor a um antígeno, a anticorpo-identificação pode igualmente ser realizada nas culturas celulares. Em particular, antígeno-apresentar pilhas imunes (pilhas de B) pode ser isolada das amostras de sangue humano, e da sua antígeno-especificidade pode ser avaliada in vitro, por exemplo etiquetando antígenos com tinturas fluorescentes e identificando que pilhas se tornam fluorescentes.

Neste caso, os ciclos da maturação do antígeno terão que ser realizados in vitro demasiado. A pesquisa precedente confiou na construção de grandes bibliotecas do mutante do anticorpo com mutações aleatórias, que selecção extensiva contudo exigida para identificar os mutantes do anticorpo que tinham retido a antígeno-especificidade mas tinham melhorado a força da antígeno-ligação.

Estude neste caso, os pesquisadores franceses conduzidos por professores Richard Breathnach e Xavier Saulquin (Nantes) demonstrou que uma aproximação baseada CRISPR-X pode ser usada in vitro para induzir mutações nos locais específicos de um gene do anticorpo, melhorando sua força antígeno-obrigatória sem comprometer na especificidade do antígeno.

indicadores CRISPR-controlados da mutação

Os cientistas usaram doações de sangue humano do formulário das pilhas imunes para desenvolver um anticorpo contra um antígeno do exemplo. Para uns estudos mais adicionais, seleccionaram um anticorpo que não se acabasse forte em ligar o antígeno. Após o isolamento do anticorpo-gene, usaram aproximações genéticas ao transfect uma linha celular humana para produzir o anticorpo.

As mutações foram introduzidas no gene do anticorpo usando CRISPR-X. O gene convencional de CRISPR que edita o sistema compreende um RNA do guia (gRNA) para a identificação de uma seqüência do ADN do alvo, e uma enzima Cas9 associada que fenda o ADN no local reconhecido pelo gRNA.

Com CRISP-X, contudo, uma variação Cas9 “inoperante” é usada que ligue somente ao gRNA reconheça o local, e recrute as enzimas adicionais que são capazes de introduzir mutações do ADN no cerco do local obrigatório. Usando esta técnica, os investigador geraram as variações do anticorpo que foram transformadas somente em determinadas regiões do gene, contudo permitir a variabilidade considerável para a edição do gene.

In vitro aumentos da “maturação” que ligam a força

Com somente dois ciclos da mutação e da selecção, os cientistas podiam ao maturate seu anticorpo original em uma versão com força antígeno-obrigatória mais forte de 80 dobras. Desde que tinham realizado o procedimento in vitro em culturas celulares, estes ciclos de duas mutações exigiram somente seis semanas do tempo.

Talvez a grande oportunidade deste método da geração do anticorpo encontra-se no facto de que a seqüência original do anticorpo saiu do sistema imunitário de um doador humano, quando a maturação fez não exigido o organismo humano.

Para muitas revelações do anticorpo, os antígenos são injectados em animais (por exemplo ratos) para usar seu sistema imunitário para a identificação do anticorpo. O risco é que quando injetado em seres humanos, o anticorpo animal-derivado se assemelhará a um antígeno estrangeiro e estará atacado pelo sistema imunitário humano. Começar das pilhas imunes humanas e maturating os anticorpos in vitro podem conseqüentemente melhorar a segurança dos anticorpos para o uso terapêutico.

Conflitos de interesses

Os autores do estudo declaram em sua publicação que a amostra do sangue dos assuntos humanos tinha sido aprovada pelo comité de ética local CPP Ouest grande IV (número de referência: MESR DC-2017-2987).

Source

Devilder MC e outros, ex vivo evolução de anticorpos humanos por CRISPR-X: de um repertório ingénuo da pilha de B à afinidade amadureceu anticorpos. Biotecnologia 2019 de BMC, 19, artigo número 14; DOI: 10.1186/s12896-019-0504-z.

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Last Updated: Oct 16, 2019

Christian Zerfaß, Ph.D.

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Christian Zerfaß, Ph.D.

Christian is an enthusiastic life scientist who wants to understand the world around us. He was awarded a Ph.D. in Protein Biochemistry from Johannes Gutenberg University in Mainz, Germany, in 2015, after which he moved to Warwick University in the UK to become a post-doctoral researcher in Synthetic Biology.

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