Perfeccionar afinidad del anticuerpo usando CRISPR

Las muestras de sangre humanas se pueden utilizar para producir los anticuerpos contra un antígeno del interés. Puesto que la sangre contiene la antígeno-presentación de las células inmunes, la identificación del anticuerpo requiere solamente un análisis obligatorio determinar las células que presentan los anticuerpos convenientes.

Sin embargo, esto selecciona para los anticuerpos “tempranos”, que en el organismo experimentarían la maduración por los cartuchos múltiples de la mutación y de la selección, llevando a los anticuerpos que son más efectivos en antígeno-atar. El trabajo de los investigadores franceses sugiere que un sistema de CRISPR se pueda utilizar para impulsar un proceso de maduración equivalente in vitro.

Esta investigación fue publicada en la biotecnología del gorrón BMC.

Célula no nativa circundante de los anticuerpos después de la maduraciónHaber de imagen: Design_Cells/Shutterstock.com

Maduración del anticuerpo in vivo

Los anticuerpos mantienen gran promesa pues terapéutico los agentes, y de hecho, son ya funcionando para el tratamiento de una variedad de enfermedades. Como gran característica, los anticuerpos para los antígenos específicos se pueden aislar de donantes humanos. Por ejemplo, el sistema inmune de una persona que fue expuesta previamente a un antígeno (e.g de una infección viral o bacteriana, o una vacunación) tentativa determinar un anticuerpo efectivo que neutralice el antígeno.

Una vez que se encuentra un anticuerpo conveniente, experimenta los ciclos de la maduración a través de los cuales la serie del anticuerpo será optimizada para aumentar su eficacia en el atascamiento del antígeno. Los anticuerpos resultantes se pueden determinar experimental de muestras de sangre por análisis obligatorios del antígeno, y si es acertado el anticuerpo se puede producir biotecnológicamente por técnicas establecidas.

Para evitar que un tema humano tiene que ser expuesto a un antígeno, la anticuerpo-identificación se puede también realizar en cultivos celulares. Particularmente, la antígeno-presentación de las células inmunes (células de B) se puede aislar de muestras de sangre humanas, y de su antígeno-especificidad se puede fijar in vitro, por ejemplo etiqueta los antígenos con los tintes fluorescentes y determinando qué células llegan a ser fluorescentes.

En este caso, los ciclos de la maduración del antígeno tendrán que ser realizados in vitro también. La investigación anterior ha confiado en la construcción de las bibliotecas grandes del mutante del anticuerpo con las mutaciones al azar, que investigación extensa sin embargo requerida para determinar los mutantes del anticuerpo que habían conservado antígeno-especificidad pero habían perfeccionado la fuerza de antígeno-atar.

En este caso estudie, los investigadores franceses llevados por profesores Richard Breathnach y Javier Saulquin (Nantes) demostró que una aproximación basada CRISPR-X se puede utilizar in vitro para inducir mutaciones en los sitios específicos de un gen del anticuerpo, perfeccionando su fuerza antígeno-obligatoria sin el compromiso en especificidad del antígeno.

ventanas CRISPR-controladas de la mutación

Los científicos utilizaron donaciones de sangre humana de la forma de las células inmunes para desarrollar un anticuerpo contra un antígeno del ejemplo. Para otros estudios, seleccionaron un anticuerpo que no había terminado fuerte en atar el antígeno. Después del aislamiento del anticuerpo-gen, utilizaron aproximaciones genéticas al transfect una variedad de células humana para producir el anticuerpo.

Las mutaciones fueron introducidas en el gen del anticuerpo usando CRISPR-X. El gen convencional de CRISPR que corrige el sistema comprende un ARN de la guía (gRNA) para la identificación de una serie de la DNA del objetivo, y una enzima asociada Cas9 que hienda la DNA en el sitio reconocido por el gRNA.

Con CRISP-X, sin embargo, se utiliza una variante “muerta” Cas9 que ata solamente al gRNA reconoció el sitio, y recluta las enzimas adicionales que son capaces de introducir mutaciones de la DNA en el cerco del punto de enlace. Usando esta técnica, los investigadores generaron las variantes del anticuerpo que fueron transformadas solamente en ciertas regiones del gen, con todo permitir la considerable variabilidad para corregir del gen.

In vitro aumentos de la “maduración” que atan fuerza

Con solamente dos ciclos de la mutación y de la selección, los científicos podían al maturate su anticuerpo original en una versión con una fuerza antígeno-obligatoria más fuerte de 80 dobleces. Puesto que habían realizado el procedimiento en cultivos celulares ines vitro, estos ciclos de dos mutaciones requirieron solamente seis semanas de tiempo.

La oportunidad más grande de este método de generación del anticuerpo miente quizá en el hecho de que la serie original del anticuerpo salió del sistema inmune de un donante humano, mientras que lo hizo la maduración no requerido el organismo humano.

Para muchos progresos del anticuerpo, los antígenos se inyectan en los animales (e.g ratones) para utilizar su sistema inmune para la identificación del anticuerpo. El riesgo es que cuando está inyectado en seres humanos, el anticuerpo animal-derivado se asemejará a un antígeno no nativo y será atacado por el sistema inmune humano. El comienzo de las células inmunes humanas y maturating los anticuerpos in vitro pueden por lo tanto perfeccionar el seguro de los anticuerpos para el uso terapéutico.

Conflictos de intereses

Los autores del estudio declaran en su publicación que el muestreo de la sangre de temas humanos había sido aprobado por el comité de ética local CPP Ouest magnífico IV (número de referencia: MESR DC-2017-2987).

Fuente

Devilder bujía métrica y otros, ex vivo evolución de anticuerpos humanos por CRISPR-X: de un repertorio ingenuo del linfocito B a la afinidad maduró los anticuerpos. Biotecnología 2019, 19, artículo número 14 de BMC; DOI: 10.1186/s12896-019-0504-z.

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Last Updated: Oct 16, 2019

Christian Zerfaß, Ph.D.

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Christian Zerfaß, Ph.D.

Christian is an enthusiastic life scientist who wants to understand the world around us. He was awarded a Ph.D. in Protein Biochemistry from Johannes Gutenberg University in Mainz, Germany, in 2015, after which he moved to Warwick University in the UK to become a post-doctoral researcher in Synthetic Biology.

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