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Melhorando a qualidade e a eficiência da cromatografia

Na cromatografia, os componentes de uma mistura são separados. Isto é tornado a possível porque os componentes diferentes interagem com o móvel e fases contínuas diferentemente, assim sendo retido na coluna (se liga fortemente à fase contínua) ou não interagindo com a coluna de todo.

Câmaras de ar que contêm amostras para a cromatografia - pelo hotsumCrédito de imagem: hotsum/Shutterstock

Estes factores podem ser mudados de modo que o processo possa ser mais eficiente em termos de quanto tempo a corrida toma e do quanto os reagentes são exigidos para a corrida da cromatografia. Contudo, precisa de ser tomado para assegurar a boa definição.

Eficiência da coluna

A fim determinar a eficiência da coluna, e assim a capacidade da cromatografia obter a boa definição, há dois factores que são importantes de considerar: máximo máximo e larguras máximas.

O máximo máximo é onde a concentração do composto é a mais alta, tendo por resultado o pico o maior. Onde o máximo máximo cai para dois compostos diferentes depende de como interagem com a coluna, assim como de como interagem com a fase móvel.

A largura máxima, ou como largamente os picos são, é de um interesse maior na cromatografia. Mesmo se os máximos de dois picos estão resolvidos bem, se estes picos se tornam mais largamente, a seguir este pôde afectar a definição dos dois picos.

A fim determinar como eficiente uma coluna de cromatografia é, a seguinte equação pode ser aplicada:

N = 16 (t/w)r2

Aqui, N é o número de placas teóricas na coluna, onde tr é o tempo de retenção, ou quanto tempo o composto está retido na coluna depois que a mistura é injectada, e w está a uma largura máxima. A largura máxima é medida desenhando uma linha de tangente e medindo a distância entre os pontos onde a linha de tangente cruza o pico.

Qualidade da cromatografia

Os resultados dos picos de um indicador do cromatograma geralmente, e a definição são quanto dois picos podem ser distinguido de se. A definição é um factor importante para considerar quando projetando uma experiência que envolve a cromatografia, e como uma equação, a definição pode ser indicada como

R = (tr2 - t)r1    

    ½ (w1 + w2)

onde t = tempos de retenção, e w = larguras do pico.

Com relação à eficiência da coluna, o valor de N relaciona-se à qualidade do cromatograma. Por exemplo, se os picos ocorrem cedo (isto é o valor de tr na equação da eficiência é baixo), e seja largo (isto é o valor de w é alto), a seguir o valor de N será baixo. O oposto é igualmente verdadeiro. Um bom cromatograma teria um valor alto de N baseado em t alto e em baixosr valores de w na equação da eficiência.

Como melhorar a eficiência da cromatografia

Refinando anticorpos monoclonais

Os anticorpos monoclonais têm usos múltiplos, tais como diagnósticos, terapêutica, purificação da proteína e outras técnicas moleculars. Estes podem ser produzidos pela cultura celular, ou in vitro, e precisam de ser refinadas do líquido da cultura celular.

A proteína A é uma proteína feita por uma bactéria, o estafilococo - áureo, que liga aos anticorpos. Esta proteína pode conseqüentemente ser usada para separar anticorpos de uma amostra misturada, como o líquido da cultura celular.

Durante a fabricação de anticorpos monoclonais, o líquido da cultura celular é carregado em uma coluna de cromatografia com a proteína A e o líquido é passado com as épocas múltiplas. Estas colunas não são baratas, e esclarecem a maioria do custo da produção do anticorpo monoclonal.

Purificação da cultura celular

Mahajan desenvolveu e outros um método contínuo onde o líquido da cultura celular eluted de uma coluna fosse passado completamente em um segundo, e então em uma terceira coluna. Usar três colunas aumentou a capacidade de ligação da cromatografia, tendo por resultado uma corrida mais eficiente.

Isto conduziu então a uma redução no tempo tomado para executar a cromatografia, devido ao facto de que cada coluna estava carregada com o líquido da cultura celular ou lavada.

Usar este processo não mostrou nenhuma diminuição na qualidade dos anticorpos refinados resultantes comparados aos processos que são usados actualmente. Assim, este processo de usar três colunas é simultaneamente mais maneira eficaz de refinar anticorpos do líquido da cultura celular.

Fontes

Further Reading

Last Updated: Oct 25, 2018

Dr. Maho Yokoyama

Written by

Dr. Maho Yokoyama

Dr. Maho Yokoyama is a researcher and science writer. She was awarded her Ph.D. from the University of Bath, UK, following a thesis in the field of Microbiology, where she applied functional genomics to Staphylococcus aureus . During her doctoral studies, Maho collaborated with other academics on several papers and even published some of her own work in peer-reviewed scientific journals. She also presented her work at academic conferences around the world.

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