Amélioration de la sécurité de Biotherapeutics : Découverte de l'inhibiteur de la protéase AEBSF avec RPLC-UV

Les anticorps sont des agents hautement sélecteurs qui peuvent être employés pour viser un grand choix de cancers et d'infections pathogènes chez l'homme. La production d'anticorps est habituellement effectuée utilisant la culture cellulaire mammifère. Cependant, pendant la production, ces cellules produisent les protéases qui dégradent les anticorps, de ce fait rendant nécessaire l'utilisation des inhibiteurs de la protéase.

Les scientifiques de l'institut de la santé national ont expliqué une méthode pour mesurer un inhibiteur de la protéase courant, nommé AEBSF, par la chromatographie liquide à phase renversée accouplée au dépistage UV (RPLC-UV) pour évaluer la purification d'anticorps.

Anticorps dans le sangKateryna Kon | Shutterstock

Les anticorps représentent une composante polyvalente du système immunitaire mammifère. Les anticorps empêchent la propagation des infections pathogènes et permettent au système immunitaire de libérer des infections. La sélectivité des anticorps est d'intérêt particulier pour le développement pharmaceutique, car des anticorps peuvent être employés dans des traitements visés. En fait, plusieurs anticorps monoclonaux ont été reconnus pour l'usage médicinal par la FDA et recherchent dans anticancéreux et les anticorps d'anti-VIH progresse.

Une fois un anticorps contre un agent pathogène particulier est recensé, par exemple dans un patient qui a l'immunité acquise, sa séquence peut être déterminée, des vecteurs de transfection peuvent être préparés et l'anticorps être produits utilisant les lignées cellulaires transgéniques. Cependant, après que l'anticorps soit synthétisé, il doit être protégé contre les machines protéolytiques de la culture cellulaire.

Une méthode classique est d'ajouter les agents chimiques qui empêchent des protéases. Tandis que ceci améliore la puissance d'anticorps, ces agents doivent être retirés en traitant en aval de sorte qu'ils ne contaminent pas le produit pharmaceutique final. Pour le contrôle qualité pharmaceutique, des méthodes courantes doivent être effectuées pour expliquer la conformité de produit.

Les scientifiques du programme vaccinique de production de NIH aux Etats-Unis, aboutis par M. Paula Lei, ont développé récemment une méthode pour mesurer l'inhibiteur de la protéase AEBSF (4 fluorure de benzenesulfonyl (2-aminoethyl)) par la chromatographie liquide à phase renversée avec le dépistage UV (RPLC-UV). Cet inhibiteur de la protéase précédemment a été avec succès employé pour la production « des anticorps grand de neutralisation » (bNAb) contre l'espèce (HIV) 1. de virus de l'immunodéficience humaine.

Contrôle qualité de RPLC-UV pour des méthodes de purification

Les chercheurs ont employé la chromatographie C18 à phase renversée avec l'eau et l'acétonitrile acidifiés comme solvants. Avec un temps d'exécution de 23 mn, ils ont réalisé la séparation d'AEBSF et de son produit d'hydrolyse, AEBS-OH ((2-aminoethyl) acide 4 benzenesulfonic).

Puisque le signe de l'inhibiteur de la protéase, AEBSF n'était pas resolved bon dans des échantillons de culture cellulaire à cause d'interférence d'autres composés, ils activement hydrolysés le composé et > la conversion réalisée de 99 % en AEBS-OH dans une incubation de 2 heures.

Les chercheurs avaient l'habitude la méthode pour analyser l'inhibiteur de la protéase dans les cultures des cellules produisant l'anticorps de bNAb et ont évalué les opérations suivantes de purification d'anticorps. Premièrement, ils ont vérifié une méthode classique pour la purification d'anticorps basée sur la chromatographie d'affinité de la protéine A.

Dans cette méthode, des anticorps sont maintenus sur une modification de chromatographie par le détail grippant avec la protéine A, alors que d'autres composés peuvent être enlevés. Deuxièmement, ils ont vérifié une méthode d'ultra-filtration où les petits composés, tels que l'inhibiteur de la protéase, traversent une modification poreuse tandis que de grands anticorps sont maintenus.

Une solution efficace

Avec leur méthode analytique neuve, les chercheurs ont expliqué que les deux la chromatographie d'affinité de la protéine A, et la méthode d'ultra-filtration étaient efficaces pour épurer la fraction d'anticorps de bNAb de l'inhibiteur de la protéase. Leur étude a proposé qu'une purification en deux étapes suivre les deux méthodes pourrait réduire la concentration d'AEBSF et de son produit AEBS-OH d'hydrolyse par plus le fois de 18.000.

L'étude fournit ainsi une méthode analytique pour assurer la qualité du démontage d'AEBSF des produits d'anticorps. La note de chercheurs, cependant, qu'AEBSF et AEBS-OH n'ont pas été toxicologiquement examinée encore, que le moyen il n'est pas connu jusqu'à quelle concentration ils peuvent être considéré sûre pour des êtres humains et combien résidu dans l'échantillon épuré d'anticorps coûterait acceptable. Ainsi, l'élaboration ultérieure de la méthode de purification sera nécessaire.

Sources

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Last Updated: Jul 18, 2019

Christian Zerfaß, Ph.D.

Written by

Christian Zerfaß, Ph.D.

Christian is an enthusiastic life scientist who wants to understand the world around us. He was awarded a Ph.D. in Protein Biochemistry from Johannes Gutenberg University in Mainz, Germany, in 2015, after which he moved to Warwick University in the UK to become a post-doctoral researcher in Synthetic Biology.

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