Miglioramento della sicurezza di Biotherapeutics: Rintracciamento dell'inibitore di proteasi AEBSF con RPLC-UV

Gli anticorpi sono agenti altamente selettivi che possono essere usati per mirare a vari cancri ed infezioni patogene in esseri umani. La produzione dell'anticorpo è effettuata solitamente facendo uso di coltura cellulare mammifera. Tuttavia, durante la produzione, queste celle producono le proteasi che degradano gli anticorpi, così necessitanti l'uso degli inibitori di proteasi.

Gli scienziati dall'istituto della sanità nazionale hanno dimostrato un metodo per quantificare un inibitore di proteasi comune, definito AEBSF, da cromatografia a fase mobile liquida in controfase accoppiata a rilevazione UV (RPLC-UV) per valutare la depurazione dell'anticorpo.

Anticorpo nel sangueKateryna Kon | Shutterstock

Gli anticorpi rappresentano una componente versatile del sistema immunitario mammifero. Gli anticorpi inibiscono la diffusione delle infezioni patogene e che permettono che il sistema immunitario annulli le infezioni. La selettività degli anticorpi è di interesse particolare per lo sviluppo farmaceutico, poichè gli anticorpi possono essere utilizzati nelle terapie mirate a. Infatti, parecchi anticorpi monoclonali sono stati approvati per uso medicinale da FDA e ricercano su anticancro e gli anticorpi anti-HIV sta progredendo.

Un anticorpo contro un agente patogeno particolare è identificato una volta, per esempio in un paziente che ha immunità acquistata, la sua sequenza può essere risoluta, i vettori di transfezione possono essere preparati e l'anticorpo essere prodotti facendo uso delle linee cellulari transgeniche. Tuttavia, dopo che l'anticorpo è sintetizzato, deve essere protetto contro il macchinario proteolitico della coltura cellulare.

Un metodo comune è di aggiungere gli agenti chimici che inibiscono le proteasi. Mentre questo migliora il rendimento dell'anticorpo, questi agenti devono essere eliminati nel trattamento a valle in modo che non contaminino il prodotto farmaceutico definitivo. Per controllo di qualità farmaceutico, i metodi sistematici devono essere effettuati per dimostrare la conformità del prodotto.

Gli scienziati dal programma vaccino di produzione di NIH in U.S.A., piombo dal Dott. Paula Lei, hanno sviluppato di recente un metodo per quantificare l'inibitore di proteasi AEBSF (4 fluoruro di benzenesulfonyl (2-aminoethyl)) da cromatografia a fase mobile liquida in controfase con rilevazione UV (RPLC-UV). Questo inibitore di proteasi precedentemente è stato usato con successo per la produzione “degli anticorpi largamente di neutralizzazione„ (bNAb) contro la varietà virale (HIV) di virus dell'immunodeficienza umana 1.

Controllo di qualità di RPLC-UV per i metodi di depurazione

I ricercatori hanno usato la cromatografia in controfase C18 con acqua ed acetonitrile acidificati come solventi. Con un tempo di esecuzione di 23 minuti, hanno raggiunto la separazione di AEBSF e di suo prodotto di idrolisi, AEBS-OH ((2-aminoethyl) acido benzenesulfonic 4).

Dal segnale dell'inibitore di proteasi, AEBSF non era risolto buono nei campioni della coltura cellulare a causa di interferenza da altri composti, attivamente hanno idrolizzato il composto ed hanno raggiunto > la conversione di 99% a AEBS-OH all'interno di un'incubazione di 2 ore.

I ricercatori hanno usato il metodo per analizzare l'inibitore di proteasi nelle culture delle celle producendo l'anticorpo del bNAb ed hanno valutato i punti successivi di depurazione dell'anticorpo. In primo luogo, hanno verificato un metodo comune a depurazione dell'anticorpo basata sulla cromatografia di affinità della proteina A.

In questo metodo, gli anticorpi sono conservati su una matrice della cromatografia tramite l'associazione specifica con la proteina A, mentre altri composti possono essere rimossi. Secondariamente, hanno verificato un metodo di ultrafiltrazione dove i piccoli composti, quale l'inibitore di proteasi, attraversano una matrice porosa mentre i grandi anticorpi sono conservati.

Una soluzione efficiente

Con il loro nuovo metodo analitico, i ricercatori hanno dimostrato che entrambi la cromatografia di affinità della proteina A ed il metodo di ultrafiltrazione erano efficienti depurare la frazione dell'anticorpo del bNAb dall'inibitore di proteasi. Il loro studio ha suggerito che una depurazione in due tappe facendo uso di entrambi i metodi potrebbe diminuire la concentrazione di AEBSF e di suo prodotto AEBS-OH di idrolisi più di dalla volta 18.000.

Lo studio fornisce così un metodo analitico per assicurare la qualità di rimozione di AEBSF dai prodotti dell'anticorpo. La nota dei ricercatori, tuttavia, che AEBSF e AEBS-OH non sono stati esaminati tossicologicamente ancora, che il mezzo non è conosciuto fino a quale concentrazione possono essere considerati sicura per gli esseri umani e quanta residuo nel campione depurativo dell'anticorpo sarebbe accettabile. Quindi, ulteriore elaborazione del metodo di depurazione sarà necessaria.

Sorgenti

  • Cai CX et al., quantificazione delle impurità in relazione con AEBSF residue da cromatografia a fase mobile liquida in controfase. Giornale di cromatografia B 2019, 1116, 19-23; DOI: 10.1016/j.jchromb.2019.03.022.
  • Ecker dm et al., il servizio terapeutico dell'anticorpo monoclonale. MAbs 2015, 7 (1), 9-14; DOI: 10.4161/19420862.2015.989042.
  • Li F et al., procedimenti della coltura cellulare per produzione dell'anticorpo monoclonale. MAbs 2010, 2 (5), 466-477; DOI: 10.4161/mabs.2.5.12720.

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Last Updated: Jul 18, 2019

Christian Zerfaß, Ph.D.

Written by

Christian Zerfaß, Ph.D.

Christian is an enthusiastic life scientist who wants to understand the world around us. He was awarded a Ph.D. in Protein Biochemistry from Johannes Gutenberg University in Mainz, Germany, in 2015, after which he moved to Warwick University in the UK to become a post-doctoral researcher in Synthetic Biology.

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