Melhorando a segurança de Biotherapeutics: Seguindo o inibidor de Protease AEBSF com RPLC-UV

Os anticorpos são os agentes altamente selectivos que podem ser usados para visar uma variedade de cancros e infecções patogénicos nos seres humanos. A produção do anticorpo é realizada geralmente usando a cultura celular mamífera. Contudo, durante a produção, estas pilhas produzem os proteases que degradam os anticorpos, assim necessitando o uso de inibidores de protease.

Os cientistas do instituto de saúde nacional demonstraram um método para determinar um inibidor de protease comum, denominado AEBSF, pela cromatografia líquida da inverter-fase acoplada à detecção UV (RPLC-UV) para avaliar a purificação do anticorpo.

Anticorpo no sangueKateryna Kon | Shutterstock

Os anticorpos representam um componente versátil do sistema imunitário mamífero. Os anticorpos inibem a propagação de infecções patogénicos e permitem que o sistema imunitário cancele infecções. A selectividade dos anticorpos é do interesse particular para a revelação farmacêutica, porque os anticorpos podem ser usados em terapias visadas. De facto, diversos anticorpos monoclonais foram aprovados para o uso medicinal pelo FDA e pesquisam em anticanceroso e os anticorpos anti-VIH estão progredindo.

Um anticorpo contra um micróbio patogénico particular é identificado uma vez, por exemplo em um paciente que tenha a imunidade adquirida, sua seqüência pode ser determinada, os vectores do transfection podem ser preparados e o anticorpo ser produzidos usando linha celular transgénicas. Contudo, depois que o anticorpo é sintetizado, precisa de ser protegido contra a maquinaria proteolytic da cultura celular.

Um método comum é adicionar os agentes químicos que inibem proteases. Quando isto melhorar o rendimento do anticorpo, estes agentes precisam de ser removidos no processamento rio abaixo de modo que não contaminem o produto farmacêutico final. Para o controle farmacêutico da qualidade, os métodos rotineiros precisam de ser realizados para demonstrar a conformidade do produto.

Os cientistas do programa vacinal da produção de NIH nos EUA, conduzidos pelo Dr. Paula Leu, têm desenvolvido recentemente um método para determinar o inibidor de protease AEBSF (4 fluoreto do benzenesulfonyl (2-aminoethyl)) pela cromatografia líquida da inverter-fase com detecção UV (RPLC-UV). Este inibidor de protease foi usado previamente com sucesso para a produção “de anticorpos amplamente de neutralização” (bNAb) contra a tensão de vírus 1. (HIV) da imunodeficiência humana.

Controle da qualidade de RPLC-UV para métodos da purificação

Os pesquisadores usaram a cromatografia da inverter-fase C18 com água e acetonitrilo acidificados como solventes. Com um tempo de execução de 23 minutos, conseguiram a separação de AEBSF e de seu produto da hidrólise, AEBS-OH ((2-aminoethyl) ácido 4 benzenesulfonic).

Desde o sinal do inibidor de protease, AEBSF não era resolved bom em amostras da cultura celular devido à interferência de outros compostos, activamente hydrolyzed o composto e conseguiu > a conversão de 99% a AEBS-OH dentro de uma incubação de 2 horas.

Os investigador usaram o método para analisar o inibidor de protease nas culturas das pilhas produzindo o anticorpo do bNAb e avaliaram as etapas subseqüentes da purificação do anticorpo. Em primeiro lugar, testaram um método comum para a purificação do anticorpo baseada na cromatografia de afinidade da proteína A.

Neste método, os anticorpos estão retidos em uma matriz da cromatografia pelo emperramento específico com proteína A, quando outros compostos puderem ser lavados fora. Em segundo lugar, testaram um método do ultrafiltration aonde os compostos pequenos, tais como o inibidor de protease, passassem através de uma matriz porosa quando os grandes anticorpos forem retidos.

Uma solução eficiente

Com seu método analítico novo, os pesquisadores demonstraram que ambos a cromatografia de afinidade da proteína A, e o método do ultrafiltration eram eficientes refinar a fracção do anticorpo do bNAb do inibidor de protease. Seu estudo sugeriu que uma purificação do pas-de-deux que usa ambos os métodos poderia reduzir a concentração de AEBSF e de seu produto AEBS-OH da hidrólise mais pela dobra de 18.000.

O estudo fornece assim um método analítico para assegurar a qualidade da remoção de AEBSF dos produtos do anticorpo. A nota dos pesquisadores, contudo, que AEBSF e AEBS-OH não foram examinados toxicologically ainda, que os meios ele não são conhecidos até que concentração podem ser considerados segura para seres humanos e quanto resíduo na amostra refinada do anticorpo seria aceitável. Assim, uma revelação mais adicional do método da purificação será necessária.

Fontes

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Last Updated: Jul 18, 2019

Christian Zerfaß, Ph.D.

Written by

Christian Zerfaß, Ph.D.

Christian is an enthusiastic life scientist who wants to understand the world around us. He was awarded a Ph.D. in Protein Biochemistry from Johannes Gutenberg University in Mainz, Germany, in 2015, after which he moved to Warwick University in the UK to become a post-doctoral researcher in Synthetic Biology.

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