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Dans-Cellule RMN

Les deux techniques principales pour sonder la structure d'une molécule à un niveau atomique sont cristallographie et résonance magnétique nucléaire de rayon X (NMR). la Dans-cellule RMN est habituée pour étudier la structure des molécules et des métabolites à l'intérieur d'une cellule à une définition atomique.

Crédit d'image : nobeastsofierce/Shutterstock

Le besoin de dans-cellule RMN

Le rayon X que la cristallographie exige des échantillons d'être un cristal se diffractant, tandis que RMN concerne vérifier la structure des molécules dans la solution aqueuse à la température ambiante.

Différentes interactions de protéine-protéine et de protéine-ligand peuvent être étudiées utilisant la solution RMN. Cryo-FIN DE SUPPORT ou microscopie électronique est un autre outil utilisé pour étudier les structures à une définition grande.

Cependant, il y a un besoin croissant d'observer et des propriétés de mesure des molécules dans leur condition indigène à l'intérieur des cellules, car les différentes procédures de l'isolement et la purification des molécules peuvent modifier sa condition.

Ainsi, des techniques pour sonder la condition biologique de véritables cellules de `' d'une molécule à l'intérieur d'une cellule dans son environnement indigène sont étudiées et utilisées, et la dans-cellule RMN est juste une méthode qui peut faire ceci.

technique RMN de Dans-cellule

Dans cette technique, des isotopes NR-actifs sont exprimés ou ajoutés dans la cellule. Ces isotopes comprennent 15N, 13C, et récent 19F également est employé.  Après l'expression de ces isotopes, les cellules sont mises dans un champ magnétique et la fréquence de résonance, ou la fréquence auquel les noyaux particuliers absorbent et re-émettent le rayonnement électromagnétique, est mesurées. Cette information est employée pour dériver la structure électronique de la molécule.

Expression des isotopes en cellules

Prokaryotes

la Dans-cellule RMN a été commencée par exprimer les isotopes RMN à l'intérieur des cellules d'E.coli. L'expression des molécules marquées à l'intérieur des cellules concerne grandissant les dans des medias marqués, mais ceci produit des signes de mouvement propre intenses.

L'autre sujet qui a apparu pendant la première dans-cellule RMN était que les protéines marquées ont montré une résonance grande, il était difficile discerner que les uns des autres. Une des raisons de ceci est que les bactéries ont une courte durée après quoi elles éclatent ouvert. Ceci mène au renversement des molécules marquées dans les medias, qui produit alors des spectres grands et du bruit énorme.

Ainsi, pendant la dans-cellule RMN la cellule doit être intacte pour montrer que les molecues sont dans leur véritable condition biologique. Dans les bactéries, des protéines isotopiques peuvent être exprimées en transformant les cellules avec les vecteurs d'expression qui codent pour la protéine d'intérêt.

Eucaryotes

Car les systèmes bactériens ne sont pas adaptés pour étudier les protéines eucaryotiques, la dans-cellule RMN a été exécutée en cellules eucaryotes a été également développée. Cependant, overexpressing des protéines en cellules eucaryotes présente plusieurs défis. Les techniques principales sont à cet effet aux overexpress la protéine ou à l'injection d'une protéine dedans à une cellule.

L'injection de protéine fournit plus d'avantages pendant que les niveaux de la protéine peuvent être réglés et ainsi, signes de mouvement propre produits pendant l'overexpression peut être réduite. Il y a deux autres méthodes pour introduire la protéine de l'intérêt pour les cellules eucaryotes ; on est l'utilisation des peptides cellule-pénétrants, ou des CPP, où la protéine marquée et un peptide qui peuvent se crever et présentent la cellule sont conjugués.

Suivre cette méthode, la caractéristique RMN de haute qualité a été enregistrée des cellules. Une autre méthode est l'utilisation du pore formant les toxines bactériennes qui crèvent la membrane cellulaire et la rendent perméable aux protéines modifiées.

Effet de l'encombrement sur la dans-cellule RMN

L'encombrement macromoléculaire se rapporte à une forte concentration de macromolécules dans le cytoplasme. Ce phénomène mène aux changements des propriétés se pliantes et des faibles interactions des protéines, qui affectent à leur tour les spectres rmn. On l'a observé que plusieurs protéines qui montrent à un document intrinsèquement désordonné de structure en solution une structure partiellement pliée à l'intérieur des cellules.

De même, les faibles forces interactives entre les molécules peuvent également stabiliser certaines conformations. Ainsi, l'encombrement peut influencer l'horizontal et la conformation se pliants de la protéine en in vivo conditions qui peuvent mener aux changements des signes RMN de dans-cellule.

Étude des interactions de repliement des protéines et de dans-cellule

la Dans-cellule RMN peut également être employée pour étudier des interactions protéine-protéine et la maturation de protéine. Les interactions de protéines régissent les modifications goujon-de translation, les compartiments cellulaires todifferent de translocation, et la dégradation des protéines à l'intérieur d'une cellule. De telles interactions de protéine-protéine ou de protéine-médicament ont été également étudiées utilisant la dans-cellule RMN.

Un organisme de recherche a vérifié les étapes variées de la maturation d'une protéine en mesurant les signatures RMN de dans-cellule utilisant les opérations intermédiaires. la Dans-cellule RMN a été également habituée pour étudier la translocation de protéine et l'effet des modifications environnementales locales dans différents compartiments subcellulaires sur la structure des protéines.

TRAVAIL ASSIGNÉ

Une des techniques de la dans-cellule RMN est STINT appelé, qui est habitué pour étudier les interactions protéine-protéine. Dans cette technique, les protéines sont exprimées d'une façon dépendant du temps. Le TRAVAIL ASSIGNÉ produit d'un vidéo temps-périmé des signes RMN de dans-cellule de fournir des informations sur la façon dont la structure des protéines change en réponse aux interactions protéine-protéine.

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Last Updated: Feb 26, 2019

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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