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In-Cella RMN

Le due tecniche principali per sondare la struttura di una molecola ad un livello atomico sono cristallografia a raggi x ed a risonanza magnetica nucleare (NMR). la In-cella RMN è usata per studiare la struttura delle molecole e dei metaboliti dentro una cella ad una risoluzione atomica.

Credito di immagine: nobeastsofierce/Shutterstock

L'esigenza della in-cella RMN

La cristallografia a raggi x richiede i campioni di essere un cristallo diffrangente, mentre RMN comprende studiare la struttura delle molecole nella soluzione acquosa alla temperatura ambiente.

Le interazioni differenti del proteina-legante e della proteina-proteina possono essere studiate facendo uso della soluzione RMN. Il Cryo-EM o la microscopia elettronica è un altro strumento utilizzato per studiare le strutture ad una grande risoluzione.

Tuttavia, ci sono una necessità aumentante di osservare e beni della misura delle molecole nel loro stato indigeno dentro le celle, poichè le procedure differenti di isolamento e la depurazione delle molecole possono alterare il suo stato.

Quindi, le tecniche per sondare lo stato biologico delle vere cellule del `' di una molecola dentro una cella nel suo ambiente indigeno stanno studiande ed impiegande e la in-cella RMN è appena un metodo che può fare questo.

tecnica RMN della In-cella

In questa tecnica, gli isotopi dell'NR-attivo sono espressi o si aggiungono nella cella. Questi isotopi comprendono 15N, 13C e recentemente 19la F egualmente sta usanda.  Dopo l'espressione di questi isotopi, le celle sono collocate in un campo magnetico e nella frequenza di risonanza, o la frequenza a cui nuclei particolari assorbe e ri-emette la radiazione elettromagnetica, è misurata. Questi informazioni sono usate per derivare la struttura elettronica della molecola.

Espressione degli isotopi in celle

Prokaryotes

la In-cella RMN è stata iniziata con l'espressione degli isotopi RMN dentro le celle di E.coli. L'espressione delle molecole contrassegnate dentro le celle comprende crescente nei media contrassegnati, ma questa genera i forti segnali di sfondo.

Un'altra questione che è emerso durante la in-cella in anticipo RMN era che le proteine contrassegnate hanno mostrato una vasta risonanza, che era difficile da distinguere l'uno dall'altro. Una delle ragioni per questa è che i batteri hanno una breve durata della vita dopo di che scoppiano aperto. Ciò piombo al rovesciamento delle molecole contrassegnate nei media, che poi genera i vasti spettri ed il disturbo enorme.

Quindi, durante la in-cella RMN la cella deve essere intatta provare che i molecues sono nel loro vero stato biologico. In batteri, le proteine isotopiche possono essere espresse trasformando le celle con i vettori di espressione che codificano per la proteina di interesse.

Eucarioti

Poichè i sistemi batterici non sono adatti da studiare le proteine eucariotiche, la in-cella RMN è stata eseguita in celle eucariotiche egualmente è stata diventata. Tuttavia, overexpressing le proteine in celle eucariotiche presenta parecchie sfide. Le tecniche principali a questo fine sono ai overexpress la proteina o all'iniezione di una proteina dentro ad una cella.

L'iniezione della proteina fornisce più vantaggi mentre i livelli di proteina possono essere controllati e così, segnali di sfondo generati durante la sovraespressione può essere diminuita. Ci sono altri due metodi per presentare la proteina di interesse nelle celle eucariotiche; uno è l'uso dei peptidi cella-penetranti, o CPPs, in cui la proteina contrassegnata e un peptide che possono perforare ed entrano nella cella sono coniugati.

Facendo uso di questo metodo, i dati RMN di alta qualità sono stati registrati dalle celle. Un altro metodo è l'uso del poro che forma le tossine batteriche che perforano la membrana cellulare e la rendono permeabile alle proteine modificate.

Effetto di ammucchiatura sulla in-cella RMN

L'ammucchiatura macromolecolare si riferisce ad un'alta concentrazione di macromolecole nel citoplasma. Questo fenomeno piombo ai cambiamenti nei beni d'profilatura e nelle interazioni deboli delle proteine, che a loro volta pregiudicano gli spettri RMN. È stato osservato che parecchie proteine che mostrano ad una mostra intrinsecamente disordinata della struttura in soluzione una struttura parzialmente profilatura dentro le celle.

Similmente, le forze interattive deboli fra le molecole possono anche stabilizzare determinate conformazioni. Quindi, ammucchiare può influenzare il paesaggio di piegatura e la conformazione della proteina in vivo nelle circostanze che possono piombo ai cambiamenti nei segnali RMN della in-cella.

Studio delle interazioni della in-cella e della folding proteico

la In-cella RMN può anche essere usata per studiare le interazioni della proteina-proteina e la maturazione della proteina. Le interazioni della proteina governano le modifiche post-di traduzione, i compartimenti cellulari todifferent dello spostamento e la degradazione delle proteine dentro una cella. Tali interazioni della proteina-droga o della proteina-proteina egualmente sono state studiate facendo uso della in-cella RMN.

Un gruppo di ricerca ha studiato le varie fasi di maturazione di una proteina misurando le impronte RMN della in-cella facendo uso dei punti intermedi. la In-cella RMN egualmente è stata usata per studiare lo spostamento della proteina e l'effetto dei cambiamenti ambientali locali all'interno dei compartimenti sottocellulari differenti sulla struttura delle proteine.

LIMITAZIONE

Una delle tecniche di in-cella RMN è chiamata STINT, che è usata per studiare le interazioni della proteina-proteina. In questa tecnica, le proteine sono espresse in un modo dipendente dal tempo. La LIMITAZIONE genera un video del tempo scaduto dei segnali RMN della in-cella fornire informazioni su come la struttura delle proteine cambia in risposta alle interazioni della proteina-proteina.

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Last Updated: Feb 26, 2019

Dr. Surat P

Written by

Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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