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Em-Pilha NMR

As duas técnicas principais para sondar a estrutura de uma molécula a nível atômico são cristalografia do raio X e ressonância magnética nuclear (NMR). a Em-pilha NMR é usada para estudar a estrutura das moléculas e dos metabolitos dentro de uma pilha em uma definição atômica.

Crédito de imagem: nobeastsofierce/Shutterstock

A necessidade para a em-pilha NMR

O cristalografia do raio X exige as amostras ser um cristal de difracção, quando NMR envolve investigar a estrutura das moléculas na solução aquosa na temperatura ambiente.

As interacções diferentes da proteína-proteína e da proteína-ligante podem ser estudadas usando a solução NMR. O Cryo-EM ou a microscopia de elétron são uma outra ferramenta usada para estudar as estruturas em uma grande definição.

Contudo, há uma necessidade crescente de observar e umas propriedades da medida das moléculas em seu estado nativo dentro das pilhas, porque os procedimentos diferentes do isolamento e a purificação das moléculas podem alterar seu estado.

Assim, as técnicas para sondar o estado biológico da pilha verdadeira do `' de uma molécula dentro de uma pilha em seu ambiente nativo estão sendo estudadas e empregadas, e a em-pilha NMR é apenas um método que pode fazer este.

técnica NMR da Em-pilha

Nesta técnica, os isótopos NR-activos são expressados ou adicionados na pilha. Estes isótopos incluem 15N, 13C, e F 19está sendo usado recentemente igualmente.  Após a expressão destes isótopos, as pilhas são colocadas em um campo magnético e na freqüência da ressonância, ou a freqüência em que núcleos particulares absorve e re-se emite a radiação eletromagnética, são medidas. Esta informação é usada para derivar a estrutura eletrônica da molécula.

Expressão dos isótopos nas pilhas

Prokaryotes

a Em-pilha NMR foi começada com expressar isótopos NMR dentro das pilhas de E.coli. A expressão de moléculas etiquetadas dentro das pilhas envolve crescê-las em media etiquetados, mas esta gera sinais de fundo fortes.

Outros tema que emergiram durante a em-pilha adiantada NMR eram que as proteínas etiquetadas mostraram uma ressonância larga, que fosse difícil de distinguir de uma outra. Uma das razões para esta é que as bactérias têm um tempo curto depois do qual estouram aberto. Isto conduz ao derramamento das moléculas etiquetadas nos media, que gera então espectros largos e o ruído enorme.

Assim, durante a em-pilha NMR a pilha tem que ser intacto mostrar que os molecues estão em seu estado biológico verdadeiro. Nas bactérias, as proteínas isótopas podem ser expressadas transformando as pilhas com vectores da expressão que codificam para a proteína do interesse.

Eukaryotes

Porque os sistemas bacterianos não são apropriados estudar proteínas eucarióticas, a em-pilha NMR foi executada em pilhas eucarióticas foi tornada igualmente. Contudo, overexpressing proteínas em pilhas eucarióticas apresenta diversos desafios. As técnicas principais são com esta finalidade aos overexpress a proteína ou à injecção de uma proteína dentro a uma pilha.

A injecção da proteína fornece mais vantagens como os níveis de proteína podem ser controlados e assim, sinais de fundo gerados durante o overexpression pode ser reduzida. Há outros dois métodos para introduzir a proteína do interesse nas pilhas eucarióticas; um é o uso de peptides pilha-penetrantes, ou os CPP, onde a proteína etiquetada e um peptide que podem puncionar e incorporam a pilha são conjugados.

Usando este método, os dados NMR de alta qualidade foram gravados das pilhas. Um outro método é o uso do poro que forma as toxinas bacterianas que puncionam a membrana de pilha e a fazem permeável às proteínas alteradas.

Efeito da aglomeração na em-pilha NMR

A aglomeração macromolecular refere uma concentração alta de macromoléculas no citoplasma. Este fenômeno conduz às mudanças nas propriedades de dobramento e nas interacções fracas das proteínas, que afectam por sua vez os espectros NMR. Observou-se que diversas proteínas que mostram a uma estrutura intrìnseca desorganizado na exibição da solução uma estrutura parcialmente dobrada dentro das pilhas.

Similarmente, as forças interactivas fracas entre as moléculas podem igualmente estabilizar determinadas conformações. Assim, aglomerar-se pode influenciar a paisagem e a conformação de dobramento da proteína in vivo nas circunstâncias que podem conduzir às mudanças em sinais NMR da em-pilha.

Estudando interacções da dobradura e da em-pilha de proteína

a Em-pilha NMR pode igualmente ser usada para estudar interacções da proteína-proteína e maturação da proteína. As interacções da proteína governam as alterações cargo-translational, os compartimentos celulares todifferent da translocação, e a degradação das proteínas dentro de uma pilha. Tais interacções da proteína-proteína ou da proteína-droga foram estudadas igualmente usando a em-pilha NMR.

Um grupo de investigação investigou as várias fases da maturação de uma proteína medindo as assinaturas NMR da em-pilha usando as etapas intermediárias. a Em-pilha NMR foi usada igualmente para estudar a translocação da proteína e o efeito de mudanças ambientais locais dentro dos compartimentos secundário-celulares diferentes na estrutura das proteínas.

RESTRIÇÃO

Uma das técnicas da em-pilha NMR é chamado RESTRIÇÃO, que é usada para estudar as interacções da proteína-proteína. Nesta técnica, as proteínas são expressadas em uma maneira tempo-dependente. A RESTRIÇÃO gera um vídeo tempo-decorrido de sinais NMR da em-pilha fornecer a informação em como a estrutura das proteínas muda em resposta às interacções da proteína-proteína.

Fontes:

Further Reading

Last Updated: Feb 26, 2019

Dr. Surat P

Written by

Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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