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En-Célula RMN

Las dos técnicas principales para sondar la estructura de una molécula en un nivel atómico son cristalografía de la radiografía y de resonancia magnética nuclear (NMR). la En-célula RMN se utiliza para estudiar la estructura de moléculas y de metabilitos dentro de una célula en una resolución atómica.

Haber de imagen: nobeastsofierce/Shutterstock

La necesidad de la en-célula RMN

La cristalografía de la radiografía requiere las muestras ser un cristal de difracción, mientras que el RMN implica el investigar de la estructura de moléculas en la solución acuosa en la temperatura ambiente.

Diversas acciones recíprocas de la proteína-proteína y del proteína-ligand se pueden estudiar usando la solución RMN. El Cryo-EM o la microscopia electrónica es otra herramienta usada para estudiar las estructuras en una gran resolución.

Sin embargo, hay una necesidad cada vez mayor de observar y propiedades de la dimensión de moléculas en su estado nativo dentro de las células, pues diversos procedimientos del aislamiento y la purificación de moléculas pueden alterar su estado.

Así, las técnicas para sondar el estado biológico de la célula verdadera del `' de una molécula dentro de una célula en su ambiente nativo se están estudiando y se están empleando, y la en-célula RMN es apenas un método que puede hacer esto.

técnica de la En-célula RMN

En esta técnica, los isótopos NR-activos se expresan o se agregan en la célula. Estos isótopos incluyen 15N, 13C, y F 19también se está utilizando recientemente.  Después de la expresión de estos isótopos, se miden las células se ponen en un campo magnético y la frecuencia de la resonancia, o la frecuencia en que los núcleos determinados absorbe y re-emite la radiación electromágnetica. Esta información se utiliza para derivar la estructura electrónica de la molécula.

Expresión de isótopos en células

Prokaryotes

la En-célula RMN fue comenzada con la expresión de los isótopos del RMN dentro de las células de E.coli. La expresión de moléculas etiqueta dentro de las células implica el crecer de ellas en ambientes etiqueta, pero ésta genera señales de fondo fuertes.

El otro tema que emergió durante la en-célula temprana RMN era que las proteínas etiqueta mostraron una resonancia amplia, que era difícil de distinguir a partir de la otra. Una de las razones de esto es que las bacterias tienen una vida útil corta después de lo cual reparten abierto. Esto lleva a derramarse de las moléculas etiqueta en los ambientes, que entonces genera espectros amplios y ruido enorme.

Así, durante la en-célula RMN la célula tiene que estar intacta probar que los molecues están en su estado biológico verdadero. En bacterias, las proteínas isotópicas pueden ser expresadas transformando las células con los vectores de la expresión que codifican para la proteína del interés.

Eucariotas

Pues los sistemas bacterianos no son convenientes estudiar las proteínas eucarióticas, la en-célula RMN se ha realizado en células eucarióticas también se ha convertido. Sin embargo, overexpressing las proteínas en células eucarióticas presenta varios retos. Las técnicas principales con este fin son a los overexpress la proteína o a la inyección de una proteína hacia adentro a una célula.

La inyección de la proteína ofrece más ventajas como los niveles de proteína pueden ser controlados y así, señales de fondo generadas durante el énfasis excesivo puede ser reducida. Hay dos otros métodos para introducir la proteína del interés en las células eucarióticas; uno es el uso de péptidos célula-penetrantes, o CPPs, en donde se conjugan la proteína etiqueta y un péptido que pueden pinchar e incorporan la célula.

Usando este método, los datos de alta calidad del RMN fueron registrados de las células. Otro método es el uso del poro que forma las toxinas bacterianas que pinchan la membrana celular y la hacen permeable a las proteínas modificadas.

Efecto de la apretadura sobre la en-célula RMN

La apretadura macromolecular refiere a una alta concentración de macromoléculas en el citoplasma. Este fenómeno lleva a los cambios en las propiedades que doblan y las acciones recíprocas débiles de las proteínas, que a su vez afectan a los espectros de Rmn. Fue observado que varias proteínas que muestran a estructura intrínseco desordenada en la pieza de convicción de la solución una estructura parcialmente doblada dentro de las células.

Semejantemente, las fuerzas interactivas débiles entre las moléculas pueden también estabilizar ciertas conformaciones. Así, la apretadura puede influenciar el paisaje y la conformación que doblan de la proteína en in vivo las condiciones que pueden llevar a los cambios en señales de la en-célula RMN.

Estudiar acciones recíprocas del plegamiento y de la en-célula de proteína

la En-célula RMN se puede también utilizar para estudiar acciones recíprocas de la proteína-proteína y la maduración de la proteína. Las acciones recíprocas de la proteína regulan las modificaciones poste-de translación, las divisiones celulares todifferent del desplazamiento, y la degradación de proteínas dentro de una célula. Tales acciones recíprocas de la proteína-proteína o de la proteína-droga también se han estudiado usando la en-célula RMN.

Un grupo de investigación investigó los diversos escenarios de la maduración de una proteína midiendo las firmas de la en-célula RMN usando los pasos intermedios. la En-célula RMN también se ha utilizado para estudiar el desplazamiento de la proteína y el efecto de cambios ambientales locales dentro de diversas divisiones subcelulares sobre la estructura de proteínas.

RESTRICCIÓN

Una de las técnicas de la en-célula RMN se llama STINT, que se utiliza para estudiar las acciones recíprocas de la proteína-proteína. En esta técnica, las proteínas se expresan en una manera dependiente del tiempo. La RESTRICCIÓN genera un vídeo tiempo-intervalo de las señales de la en-célula RMN de ofrecer la información en cómo la estructura de proteínas cambia en respuesta a acciones recíprocas de la proteína-proteína.

Fuentes:

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Last Updated: Feb 26, 2019

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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