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LC-MS per rilevazione ed analisi di HCP

Le proteine della cellula ospite (HCP) sono proteine recombinanti che sono espresse da una cella dell'specie differenti, conosciute come “il host„. Mentre la presenza di HCPs può soltanto essere in parziale per milione (ppm) livelli di concentrazione, sono altamente immunogene e possono avere effetti letali sui pazienti se non sono eliminate. la spettrometria di massa della Liquido-cromatografia (LC-MS) è un metodo potenziale per la rilevazione di HCPs in prodotti biofarmaceutici.

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la spettrometria di massa della Liquido-cromatografia (LC-MS) è un metodo potenziale per la rilevazione del HCPs in prodotti biofarmaceutici.Kateryna Kon | Shutterstock

Vantaggi di LC-MS per rilevazione di HCP

LC-MS combina le capacità di due metodi: cromatografia a fase mobile liquida e spettrometria di massa. La cromatografia a fase mobile liquida è usata per separare le miscele differenti, mentre la spettrometria di massa successivamente identifica le molecole separate. Ciò presenta parecchi vantaggi. In primo luogo, permette agli scienziati di identificare tutte le proteine in un campione, compreso quelle che sono non immunoreactive. Secondariamente, non richiede gli anticorpi proteina-specifici.

LC-MS ha un'alta sensibilità, può individuare le impurità all'interno delle parti per milione intervalli e può fornire qualitativamente che quantitativamente informazioni sia. Questo metodo può essere eseguito con LC-MS unidimensionale o bidimensionale.

Metodologia

In primo luogo, tutti i peptidi all'interno di un campione devono essere estratti, depurati ed essere frazionati. Il campione poi è sottoposto a cromatografia a fase mobile liquida unidimensionale o bidimensionale seguita dall'analisi spettroscopica di massa. I risultati sono inseriti in un database che contiene i risultati per le migliaia di proteine potenziali della cellula ospite.

Concentrazioni basse

Quando le proteine della cellula ospite sono presenti ai livelli molto bassi, possono co-eluirsi o precipitare con i peptidi intensi dell'anticorpo. In tali casi, una più vasta gamma dinamica può essere usata, con una fase differente della separazione. Le varie liste dell'inclusione e di esclusione possono più ulteriormente migliorare la sensibilità di LC-MS.

Modi di cromatografia di massa

Ci sono parecchi modi che possono essere usati per la rilevazione di spettrometria di massa:

  • Nel metodo del fucile da caccia, la rilevazione e la frammentazione degli ioni del peptide sono basate sull'intensità del segnale.
  • Nel metodo “mirato a„, un insieme degli ioni predeterminati del frammento è individuato dagli ioni del precursore che poi sono anticipati nella scansione di indagine.
  • I metodi “diretti„ si riferiscono alla selezione ed alla frammentazione degli ioni del peptide che sono predeterminati nella scansione di indagine.

Uno studio ha indicato che un metodo di combinazione che comprende la spettroscopia di massa diretta con i metodi bidimensionali di frazionamento poteva identificare il più alto numero di HCPs.

Metodi alternativi per la rilevazione di HCPs

I metodi corrente usati per individuare HCPs per comprendere ELISA (analisi Enzima-collegata dell'immunosorbente) e macchiare occidentale. Tuttavia, questi metodi richiedono le informazioni preliminari su HCPs, che non è requi per LC-MS. Inoltre, questi metodi sono tempo intensivo e costoso ed in molti casi, devono adattarsi hanno basato sul tipo delle cellule e sul metodo di depurazione. Inoltre, ELISA non individua HCPs che è non immunoreactive.

Un altro metodo è l'elettroforesi bidimensionale del gel. Questo metodo può essere accoppiato a microscopia di fluorescenza ed essere utilizzato in un modo semiquantitativo. Tuttavia, questo metodo ha un intervallo limitato e richiede la presenza di altri metodi di identificare il HCP.

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Last Updated: May 2, 2019

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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