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LC-MS para a detecção e a análise de HCP

As proteínas da pilha de anfitrião (HCP) são as proteínas de recombinação que são expressadas por uma pilha de uma espécie diferente, conhecidas porque o “anfitrião”. Quando a presença de HCPs puder somente estar no parte-por-milhão (ppm) níveis de concentração, são altamente imunogenéticos e podem ter efeitos letais em pacientes se não são removidos. a espectrometria em massa da Líquido-cromatografia (LC-MS) é um método potencial para a detecção de HCPs em produtos biofarmaceuticos.

Faixa clara a:

a espectrometria em massa da Líquido-cromatografia (LC-MS) é um método potencial para detectar HCPs em produtos biofarmaceuticos.Kateryna Kon | Shutterstock

Vantagens de LC-MS para a detecção de HCP

LC-MS combina as capacidades de dois métodos: cromatografia líquida e espectrometria em massa. A cromatografia líquida está usada para separar misturas diferentes, quando a espectrometria em massa identificar subseqüentemente as moléculas separadas. Isto tem diversas vantagens. Em primeiro lugar, permite cientistas de identificar todas as proteínas em uma amostra, incluindo aquelas que são não-immunoreactive. Em segundo lugar, não exige anticorpos proteína-específicos.

LC-MS tem uma sensibilidade alta, pode detectar impurezas dentro das partes por milhão escalas, e pode fornecer a informação qualitativa e quantitativa. Este método pode ser executado com o LC-MS de uma dimensão ou bidimensional.

Metodologia

Em primeiro lugar, todos os peptides dentro de uma amostra devem ser extraídos, refinado, e fraccionado. A amostra é sujeitada então à cromatografia líquida de uma dimensão ou bidimensional seguida pela análise espectroscópica em massa. Os resultados são incorporados em uma base de dados que contenha resultados para milhares de proteínas potenciais da pilha de anfitrião.

Baixas concentrações

Quando as proteínas da pilha de anfitrião estam presente a níveis muito baixos, podem co-elute ou precipitar com os peptides intensos do anticorpo. Nesses casos, um alcance dinâmico mais largo pode ser usado, com uma fase diferente da separação. As várias lista da exclusão e da inclusão podem mais aumentar a sensibilidade de LC-MS.

Modos de cromatografia em massa

Há diversos modos que podem ser usados para a detecção de espectrometria em massa:

  • No método da espingarda, a detecção e a fragmentação de íons do peptide são baseadas na intensidade do sinal.
  • No método “visado”, um grupo de íons predeterminados do fragmento é detectado dos íons do precursor que são antecipados então na varredura da avaliação.
  • Os métodos “dirigidos” referem a selecção e a fragmentação dos íons do peptide que são predeterminados na varredura da avaliação.

Um estudo mostrou que um método da combinação que envolve a espectroscopia em massa dirigida junto com métodos bidimensionais do fraccionamento podia identificar o número o mais alto de HCPs.

Métodos alternativos para a detecção de HCPs

Os métodos usados actualmente para detectar HCPs para incluir ELISA (ensaio Enzima-ligado da imunoabsorção) e a mancha ocidental. Contudo, estes métodos exigem a informação prévia sobre HCPs, que não é requi para LC-MS. Também, estes métodos são tempo intensivo e caro, e em muitos casos, precisam de ser adaptados basearam no tipo da pilha e no método da purificação. Além, ELISA não detecta HCPs que é não-immunoreactive.

Um outro método é electroforese bidimensional do gel. Este método pode ser acoplado à microscopia de fluorescência e ser usado em uma maneira semiquantitativa. Contudo, este método tem uma escala limitada e exige a presença de outros métodos identificar o HCP.

Fontes

Further Reading

Last Updated: May 2, 2019

Dr. Surat P

Written by

Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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