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Limitazioni di microscopia ottica

La microscopia ottica è una tecnica molto utile per esaminare l'aspetto di un campione con il maggior dettaglio, ma ci sono alcune limitazioni che forniscono un limite al suo uso in pratica.

Sezione trasversale del muscolo scheletrica sotto il microscopio ottico. ©Rattiya Thongdumhy/Shutterstock.com

Le limitazioni primarie dei microscopi ottici, compreso risoluzione, visualizzazione della superficie e di ingrandimento, sono descritte e discusse qui sotto. Ulteriormente, alcuni metodi per sormontare questi limitazioni o tipi alternativi di microscopi che possono essere usati invece sono coperti.

Limite di risoluzione dei microscopi ottici

Quando un microscopio ottico con indicatore luminoso trasmesso è utilizzato agli ingrandimenti molto alti, l'immagine degli oggetti del punto può essere distorta. Possono essere veduti come dischi sfocati che sono circondati dagli anelli di diffrazione, conosciuti come i dischi aerati.

Questi anelli di diffrazione limitano la capacità del microscopio ottico di risolvere i dettagli fini del campione. La potenza di risoluzione di un microscopio ottico è una misura della capacità del microscopio di distinguere fra due dettagli strutturali adiacenti, senza l'interferenza dei dischi aerati.

La grandezza della diffrazione e, quindi, della potenza di risoluzione di un microscopio ottico dipende dalla lunghezza d'onda leggera (λ) e dall'apertura diaframma numerica (NA) dell'obiettivo.  Di conseguenza, c'è un limite distinto di un microscopio ottico per osservare chiaramente i dettagli strutturali adiacenti, che è conosciuto come il limite di diffrazione del microscopio.

Ci sono egualmente parecchie tecniche che possono essere applicate per sorpassare il limite di risoluzione dell'indicatore luminoso trasmesso. Per esempio, le tecniche olografiche sono state indicate per raggiungere un più di alta risoluzione in uno studio sperimentale. Altri metodi per aumentare la risoluzione di un microscopio ottico includono:

  • Illuminazione nello spazio modulata (SMI)
  • Microscopia spettrale di distanza di precisione (SPDM)
  • Svuotamento stimolato dell'emissione della trasmissione (STED)
  • microscopia eccellente di risoluzione 3D

Ulteriormente, con l'uso di un campione fluorescente, altre tecniche possono anche essere usate per raggiungere un più di alta risoluzione. Per esempio, il quasi-campo che scandisce la microscopia ottica con le onde evanescenti e lo svuotamento dell'emissione stimolata può risultare utile.

Ingrandimento basso

L'ingrandimento massimo che può essere raggiunto tipicamente da un microscopio ottico varia da 500x a 1500x. Mentre questo livello di ingrandimento ha molti scopi e può essere utile per una serie di applicazioni pratiche, è considerevolmente più basso dell'ingrandimento che può essere raggiunto con microscopia elettronica. Al contrario, un microscopio elettronico può potere fornire gli ingrandimenti maggiori di 160,000x.

Di conseguenza, l'ingrandimento basso di un microscopio ottico è un fattore limitante per alcune applicazioni, quando un microscopio elettronico può essere adatto meglio allo scopo attuale.

Visualizzazione di superficie difficile

Simile alla limitazione di ingrandimento di microscopia ottica, la visualizzazione di superficie del campione con un microscopio ottico è sufficiente per molti scopi, ma può essere un fattore limitante. È significativamente meno chiaro che che cosa può essere raggiunto con un microscopio elettronico e questa alternativa può essere preferita in alcune situazioni.

Ciò non limita il suo uso per molte applicazioni comunque cioè quando di alta risoluzione con una chiara visualizzazione di superficie non è necessaria. Tuttavia, in alcuni casi l'elettrone o un altro tipo di microscopia può essere adatto meglio allo scopo raggiungere e mantenere una visualizzazione della superficie di alta qualità alle più alte risoluzioni.

Comparing Microscopes

Riferimenti

  1. http://www.nature.com/nprot/journal/v7/n9/fig_tab/nprot.2012.096_T1.html
  2. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21668161
  3. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2645564/
  4. http://journals.aps.org/prl/abstract/10.1103/PhysRevLett.106.193905
  5. https://www.microscopyu.com/techniques/phase-contrast/specimen-contrast-in-optical-microscopy

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Last Updated: Aug 23, 2018

Yolanda Smith

Written by

Yolanda Smith

Yolanda graduated with a Bachelor of Pharmacy at the University of South Australia and has experience working in both Australia and Italy. She is passionate about how medicine, diet and lifestyle affect our health and enjoys helping people understand this. In her spare time she loves to explore the world and learn about new cultures and languages.

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