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Microfluidic Sanger que arranja em seqüência tecnologias

Por Shelley Farrar, CAM, BSc

Arranjar em seqüência de Sanger envolve arranjar em seqüência o ADN primeiramente copiando o ADN único-encalhado adicionando nucleotides à corrente. Cada fragmento do ADN é terminado pela incorporação de um deoxynucleotide fluorescente etiquetado.

Arranjar em seqüência do ADN. Crédito de imagem: ktsdesign/Shutterstock
Arranjar em seqüência do ADN. Crédito de imagem: ktsdesign/Shutterstock

Uma seqüência é formada enquanto os fragmentos são separados pela electroforese capilar da disposição e postos então no pedido pela etiqueta fluorescente base-específica. As seqüências de sobreposição são arranjadas da saída para reflectir a seqüência genomic real.

A progressão para arranjar em seqüência automatizado do ADN começou com plataformas do sistema que consistiram em geles finos da laje, a seguir no uso dos capilares, e agora de uma microplaqueta microfabricated. Sanger que arranja em seqüência originalmente exigiu reagentes caros em volumes altos a fim cumprir o limite mínimo exigido do volume; contudo, Sanger microfluidic que arranja em seqüência tecnologias permite que os volumes de amostra sejam reduzidos proporcionalmente.

Uns avanços mais adicionais foram introduzidos; as técnicas de laboratório múltiplas usadas para arranjar em seqüência de Sanger foram integradas em uma microplaqueta, com este tipo de aplicação referido frequentemente como tecnologia da laboratório-em-um-microplaqueta do `'. As amostras são conectadas a um sistema microfluidic onde os volumes estejam na escala do nanoliter.

A estrutura de microplaquetas de Microfabricated

O ADN que arranja em seqüência microplaquetas tem uma construção da quatro-camada e é geralmente não mais do que alguns dez de centímetros quadrados. O material o mais comum usado é vidro do borofloat sob a forma de 100 bolachas do vidro do milímetro. As primeiras duas bolachas de vidro tèrmica ligadas guardaram os canais capilares da electroforese.

A terceira camada consiste às vezes em uma membrana do polydimethylsiloxane (PDMS), que junto com a camada de vidro inferior da bolacha, formam as interconexões do canal.  O material usado tem a vantagem da boa condutibilidade térmica e de uma química de superfície bem documentado. As microplaquetas podem ser fabricadas com canais profundos e estreitos a baixo custo. Tais prolongamentos geométricos altos têm a vantagem de alongar a seqüência sensibilidade da detecção lêem e aumentam.

Comparação de dispositivos de Microfluidic ao ADN precedente que arranja em seqüência métodos

O uso da produção microfluidic dos aumentos das plataformas em comparação com a electroforese capilar da disposição devido aos tempos melhorados da injecção e da separação da amostra. A electroforese capilar da disposição introduz a amostra através da injecção electrokinetic no capilar. O método tem somente uma estadia curto da injecção significar que as pequenas quantidades de amostra estão introduzidas.

Uma polarização para uns fragmentos mais curtos do ADN pode igualmente ocorrer com este método. Porque a amostra é introduzida através de uma rede do canal em dispositivos microfluidic, têm uma susceptibilidade reduzida a estes problemas da injecção. As microplaquetas microfabricated adiantadas indicaram o projecto dado forma do injector do ` um T' que foi substituído com um projecto do injector da parelha deslocada ` da cruz-T do `' ou'; isto forneceu o controle superior da amostra.

A em-microplaqueta capilar da electroforese fornece os tempos da separação que são uma electroforese capilar do que tradicional de dez vezes mais rapidamente e umas cem vezes mais rapidamente do que geles da laje.

Vantagens de Microfluidic Sanger que arranjam em seqüência tecnologias

A vantagem principal de Sanger microfluidic que arranja em seqüência tecnologias é que fornecem a integração de muitos protocolos do laboratório, incluindo a amostra que seguram, a reacção, a separação e a detecção. Quando as amostras são transportadas entre instrumentos há um risco de diluição ou de perda da amostra.

A contaminação transforma-se uma edição mais adicional durante o transporte quando a amostra contem um baixo número de cópia ou é de uma único-pilha. Nesses casos o contaminador pode oprimir a amostra. O sistema automático inteiramente integrado em dispositivos microfluidic significa que estes problemas estão evitados e há um desempenho melhorado.

How does Sanger Sequencing Work? – Seq It Out #1

A velocidade da análise igualmente aumentou devido a umas distâncias mais curtos da difusão e ao aquecimento rápido. Os métodos de aquecimento do contacto e do não-contacto foram encontrados para ser apropriados para dispositivos microfluidic. Sanger tradicional que arranja em seqüência a limpeza exige reagentes caros ou um álcool etílico de utilização limpo demorado.

Em comparação, a amostra automatizada usa menos reagente para a limpeza e é conseqüentemente mais eficaz na redução de custos. Enquanto o vidro tem um custo material alto geral, o preço da fabricação pode ser abaixado quando manufacturado em quantidades altas. Além disso, o uso crescente de plásticos baratos e os meios Sanger microfluidic dos elastómetros que arranja em seqüência tecnologias são um método eficaz na redução de custos de arranjar em seqüência do ADN.

Fontes:

  1. Kan, C. e outros 2009. ADN que arranja em seqüência e que genotyping em sistemas miniaturizados da electroforese, electroforese, 25, pp. 3564-3588. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15565709
  2. Metzker, M.L. 2005. Tecnologias emergentes no ADN que arranja em seqüência, pesquisa do genoma, 15, pp.1767- 1776. http://genome.cshlp.org/content/15/12/1767.full
  3. Paegel, B.M. e outros 2003. Dispositivos de Microfluidic para arranjar em seqüência do ADN: preparação da amostra e análise electrophoretic. Opinião actual na biotecnologia, 14, pp. 42-50. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958166902000046
  4. Bruijns, B. e outros 2016. Dispositivos para a análise judicial do ADN, Biosensors de Microfluidic, 6, e41. http://www.mdpi.com/2079-6374/6/3/41
  5. Liu, P. & Mathies, R.A. 2009. Sistemas microfluidic integrados para a análise genética de capacidade elevada, tendências na biotecnologia, 10, pp. 572-581. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19709772

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Last Updated: Feb 26, 2019

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