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Microseeding a expliqué

Microseeding est une méthode employée en cristallographie de protéine où de petits cristaux de graine peuvent être employés pour induire la formation de plus grands cristaux. Microseeding était premier montré pour produire des cristaux untwinned d'un LigM appelé composé, un O-demethylase, utilisant les cristaux untwinned comme graines.

Saut à :

La structure des protéines peut être déterminée utilisant la cristallographie, concernant microseedingSergei Drozd | Shutterstock

Jumelage en cristal

Le jumelage se produit quand deux cristaux indépendants se développent symétriquement dans différents sens du même emplacement de réseau cristallin, dû à une interruption ou à un changement du réseau pendant l'accroissement par un plus grand ion (kwown comme accroissement jumelant). Le jumelage de transformation se produit pendant le refroidissement, où un cristal devient instable et restabilizes en le transformant est structure. Une forme finale du jumelage est une déformation jumelant, qui se produit quand le cristal est mis sous la tension et subit la réorganisation.

Le jumelage est un problème bien-décelé en cristallographie de protéine, car il rend déterminant la structure cristalline d'un échantillon difficile.

Pour éviter ou rectifier ce problème, des méthodes telles que detwinning, où des cristaux sont matériel séparés, ont été développées. Le jumelage peut également être évité en optimisant la longueur de l'éclat de protéine qui peut mener à la formation des cristaux untwinned. Cependant, cette méthode exige beaucoup de temps. Microseeding offre pour cette raison une alternative viable et bonne marchée.

Microseeding contre macroseeding

L'injection est une méthode puissante pour la nucléation et l'accroissement des cristaux. Elle peut être divisée en deux types : macroseeding et microseeding. Macroseeding se réfère au transfert d'un monocristal de μm de la taille 5-50 pour commencer le procédé de la cristallisation. Tandis que dans microseeding, les graines sous-microscopiques sont employées pour commencer le procédé de cristallisation.

Dans microseeding, des cristaux untwinned sont employés comme graines et sont mis dans les gouttelettes qui sont introduites dans une condition d'équilibre aux niveaux plus bas de la sursaturation. Cette méthode peut produire de différentes structures cristallines et est également employée pour améliorer la reproductibilité de la cristallisation.

Dans une étude publiée en 2016, les chercheurs utilisés ont jumelé des cristaux de LigM comme graine pour le procédé de microseeding. Après le procédé de l'optimisation, des cristaux untwinned ont pu être produits. Microseeding a été pour cette raison considéré comme une méthode simple pour surmonter le problème du jumelage en cristallographie.

Protocole de Microseeding

Préparation de la barre de graine

D'abord, des cristaux sont lavés pour enlever la présence de tous les précipités amorphes. Les cristaux restants est alors stabilisés par la suspension dans une solution non-dissolvante de précipitant. Le processus complet est suivi à une température à laquelle les cristaux ne dissolvent pas. Par la suite, les cristaux sont écrasés dans un homogénisateur en verre et ceci est enregistré jusqu'à ce qu'eu besoin. D'autres méthodes pour pulvériser ou heurter les graines comprennent utilisant des homogénisateurs de tissu, la sonication, vortexing, des talons des graines, des tiges en verre, etc.

Dilution séquentielle

Les graines alors sont séquentiel diluées tels qu'une dilution finale est échelonnement atteint du 1:1000 au 1:10,000,000. La dilution est effectuée utilisant la solution stabilisante de précipitant. Bien qu'effectuer une barre séquentiel diluée de la graine soit une injection plus quantitative, mais de traînées est la méthode la plus facile et la plus rapide pour le transfert de la graine. L'injection de traînée est faite en réussissant simplement une tige mince enduite des cristaux de graine par la gouttelette.

Injection du procédé

Les gouttes pré-équilibrées sont striées utilisant les graines de différentes dilutions. La concentration en précipitant devrait être réduite au cas où la nucléation serait indépendant de la dilution. Cependant, si le nombre de cristaux diminue, ceci peut être adressé en augmentant la concentration du précipitant dans les graines.

Désavantages de microseeding

Bien que la cristallisation soit employée pour récupérer les protéines pures d'un bouillon impur de fermentation, cette méthode peut ne pas fonctionner dans les cas où la solution de protéine n'est pas pure. La pureté de la solution de protéine est l'un des facteurs déterminants critiques pour un succès de cette méthode.

Dans une étude, les chercheurs ont regardé l'effet de la solution de protéine contaminé avec une protéine structurellement indépendante ou structurellement la protéine assimilée. Ils ont constaté que n'importe quel genre de contamination pourrait entraver le procédé de injection.

Sources

Further Reading

Last Updated: May 1, 2019

Dr. Surat P

Written by

Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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