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Microseeding ha spiegato

Microseeding è un metodo impiegato in cristallografia della proteina dove i piccoli cristalli di seme possono essere usati per indurre la formazione di più grandi cristalli. Microseeding era primo indicato per generare i cristalli untwinned di un composto chiamato LigM, un O-demethylase, facendo uso dei cristalli untwinned come semi.

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La struttura della proteina può essere risoluta facendo uso della cristallografia, comprendente microseedingSergei Drozd | Shutterstock

Gemellaggio di cristallo

Il gemellaggio accade quando due cristalli separati si sviluppano simmetricamente nelle direzioni diverse dalle stesse posizioni del reticolo cristallino, dovuto un'interruzione o un cambiamento nella grata durante la crescita da un più grande ione (kwown come crescita che gemella). Il gemellaggio di trasformazione si presenta durante il raffreddamento, dove un cristallo diventa instabile e restabilizes trasformandolo è struttura. Un modulo definitivo di gemellaggio è deformazione che gemella, che accade quando l'a cristallo è collocato nell'ambito dello sforzo e subisce la riorganizzazione.

Il gemellaggio è un problema incontestato in cristallografia della proteina, poichè rende determinando il sistema cristallino di un campione difficile.

Per evitare o correggere questo problema, i metodi come detwinning, dove gli a cristallo sono separati fisicamente, sono stati messi a punto. Il gemellaggio può anche essere impedito ottimizzando la lunghezza del frammento della proteina che può piombo alla formazione di cristalli untwinned. Tuttavia, questo metodo richiede molto tempo. Microseeding quindi offre un'alternativa possibile e a basso costo.

Microseeding contro macroseeding

La semina è un metodo efficace per la nucleazione e la crescita dei cristalli. Può essere divisa in due classi: macroseeding e microseeding. Macroseeding si riferisce al trasferimento di un monocristallo del μm di dimensione 5-50 per iniziare il trattamento di cristallizzazione. Mentre nel microseeding, i semi submicroscopici sono usati per iniziare il trattamento di cristallizzazione.

Nel microseeding, gli a cristallo untwinned sono usati come semi e sono messi nelle goccioline che sono introdotte in uno stato di equilibrio ai livelli più bassi della soprasaturazione. Questo metodo può generare i sistemi cristallini differenti ed egualmente è usato per migliorare la riproducibilità di cristallizzazione.

In uno studio pubblicato nel 2016, i ricercatori hanno usato i cristalli doppii di LigM come il seme per il trattamento di microseeding. Dopo che il trattamento dell'ottimizzazione, cristalli untwinned potrebbe essere generato. Microseeding quindi è stato considerare come un metodo semplice per superare il problema di gemellaggio in cristallografia.

Protocollo di Microseeding

Preparazione dell'azione di seme

In primo luogo, gli a cristallo sono lavati per eliminare la presenza di tutti i precipitati amorfi. Gli a cristallo restanti poi è stabilizzato dalla sospensione in una soluzione di dissoluzione del precipitante. Il processo completo è effettuato ad una temperatura a cui i cristalli non si dissolvono. Successivamente, gli a cristallo sono schiacciati in un omogeneizzatore di vetro e memorizzare questo fino a avuto bisogno di. Altri metodi per polverizzare o fracassare i semi includono facendo uso degli omogeneizzatori del tessuto, della sonicazione, vortexing, delle perle dei semi, delle bacchette di vetro, ecc.

Diluizione seriale

I semi poi seriale sono diluiti tali che una diluizione definitiva è gamma raggiunta dal 1:1000 al 1:10,000,000. La diluizione è effettuata facendo uso della soluzione di stabilizzazione del precipitante. Sebbene fare un'azione seriale diluita del seme sia la semina strisce ma, più quantitativa è il metodo più facile e più veloce per il trasferimento del seme. La semina della striscia è fatta semplicemente passando i bastoncini sottili ricoperti di cristalli di seme attraverso la gocciolina.

Semina del trattamento

Le gocce preequilibrate sono striate facendo uso dei semi delle diluizioni differenti. La concentrazione nel precipitante dovrebbe essere diminuita nel caso la nucleazione sia indipendente dalla diluizione. Tuttavia, se il numero dei cristalli diminuisce, questo può essere indirizzato aumentando la concentrazione di precipitante nei semi.

Svantaggi di microseeding

Sebbene la cristallizzazione sia usata per recuperare le proteine pure da un brodo impuro di fermentazione, questo metodo non può lavorare nei casi in cui la soluzione della proteina non è pura. La purezza della soluzione della proteina è uno dei fattori di determinazione critici per un risultato di successo di questo metodo.

In uno studio, i ricercatori hanno esaminato l'effetto della soluzione della proteina contaminato con una proteina strutturalmente indipendente o strutturalmente una simile proteina. Hanno trovato che qualunque genere di contaminazione potrebbe ostacolare il trattamento di semina.

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Last Updated: May 1, 2019

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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