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Microseeding explicou

Microseeding é um método usado no cristalografia da proteína onde os cristais de semente pequenos podem ser usados para induzir a formação de cristais maiores. Microseeding era primeiro mostrado para gerar cristais untwinned de um composto chamado LigM, um O-demethylase, usando cristais untwinned como sementes.

Faixa clara a:

A estrutura da proteína pode ser determinada usando o cristalografia, envolvendo microseedingSergei Drozd | Shutterstock

Junção de cristal

Juntar ocorre quando dois cristais separados crescem simetricamente em sentidos diferentes dos mesmos lugar da estrutura de cristal, devido a uma interrupção ou a uma mudança na estrutura durante o crescimento por um íon maior (kwown como o crescimento que junta). O junção da transformação ocorre durante refrigerar, onde um cristal se torna instável e se restabilizes transformando o é estrutura. Um formulário final do junção é a deformação que junta, que ocorre quando o cristal é colocado sob o esforço e se submete à reorganização.

Juntar é um problema incontestado no cristalografia da proteína, porque faz determinando a estrutura de cristal de uma amostra difícil.

Para evitar ou corrigir este problema, os métodos tais como detwinning, onde os cristais são separados fisicamente, foram desenvolvidos. Juntar pode igualmente ser impedido aperfeiçoando o comprimento do fragmento da proteína que pode conduzir à formação de cristais untwinned. Contudo, este método exige muito tempo. Microseeding oferece conseqüentemente uma alternativa viável, barata.

Microseeding contra macroseeding

Semear é um método poderoso para a nucleação e o crescimento dos cristais. Pode ser dividida em duas classes: macroseeding e microseeding. Macroseeding refere transferência de um único cristal do μm do tamanho 5-50 para iniciar o processo de cristalização. Quando em microseeding, as sementes submicroscópicas forem usadas para iniciar o processo da cristalização.

Em microseeding, os cristais untwinned são usados como sementes e postos nas gotas que são trazidas em um estado de equilíbrio em níveis inferiores do supersaturation. Este método pode gerar estruturas de cristal diferentes e é usado igualmente para melhorar a reprodutibilidade da cristalização.

Em um estudo publicado em 2016, os pesquisadores usados juntaram cristais de LigM como a semente para o processo de microseeding. Após o processo de optimização, os cristais untwinned podiam ser gerados. Microseeding foi considerado conseqüentemente como um método simples para superar o problema do junção no cristalografia.

Protocolo de Microseeding

Preparando o estoque de semente

Primeiramente, os cristais são lavados para remover a presença de todos os precipitates amorfos. Os cristais restantes são estabilizados então pela suspensão em uma solução dedissolução do precipitant. O todo o processo é realizado em uma temperatura em que os cristais não se dissolvem. Subseqüentemente, os cristais são esmagados em um homogenizador de vidro e este esteja armazenado até que necessário. Outros métodos para pulverizar ou despedaçar as sementes incluem usando homogenizador do tecido, sonication, vortexing, grânulos das sementes, hastes de vidro, etc.

Diluição de série

As sementes são diluídas então em série tais que uma diluição final é agrupamento alcançado do 1:1000 ao 1:10,000,000. A diluição é realizada usando a solução de estabilização do precipitant. Embora a factura de um estoque em série diluído da semente seja uma semeação das mais quantitativa, mas raias é o método o mais fácil e o mais rápido para transferência da semente. A semeação da raia é feita simplesmente passando uma haste fina revestida com os cristais de semente através da gota.

Semeando o processo

As gotas preequilibrated são listadas usando sementes de diluições diferentes. A concentração do precipitant deve ser reduzida caso que a nucleação é independente da diluição. Contudo, se o número de cristais diminui, isto pode ser endereçado aumentando a concentração de precipitant nas sementes.

Desvantagens de microseeding

Embora a cristalização seja usada para recuperar proteínas puras de um caldo impuro da fermentação, este método não pode trabalhar nos casos onde a solução da proteína não é pura. A pureza da solução da proteína é um dos factores de determinação críticos para um resultado satisfatório deste método.

Em um estudo, os pesquisadores olharam o efeito da solução da proteína contaminado com uma proteína estrutural não relacionada ou estrutural a proteína similar. Encontraram que qualquer tipo da contaminação poderia impedir do processo de semeação.

Fontes

Further Reading

Last Updated: May 1, 2019

Dr. Surat P

Written by

Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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