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Microseeding explicó

Microseeding es un método usado en cristalografía de la proteína donde los pequeños cristales de semilla se pueden utilizar para inducir la formación de cristales más grandes. Microseeding era primer mostrado para generar cristales untwinned de una composición llamada LigM, un O-demethylase, usando cristales untwinned como semillas.

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La estructura de la proteína puede ser resuelta usando la cristalografía, implicando microseedingSergei Drozd | Shutterstock

Aparejamiento cristalino

El aparejamiento ocurre cuando dos cristales separados crecen simétricamente en diversas direcciones de las mismas situaciones del enrejado cristalino, debido a una interrupción o a un cambio en el enrejado durante incremento por un ión más grande (kwown como incremento que hermana). El aparejamiento de la transformación ocurre durante el enfriamiento, donde un cristal llega a ser inestable y restabilizes transformándolo es estructura. Una forma final del aparejamiento es la deformación que hermana, que ocurre cuando el cristal se coloca bajo tensión y experimenta la reorganizaci n.

El aparejamiento es un problema bien reconocido en cristalografía de la proteína, pues hace determinando la estructura cristalina de una muestra difícil.

Para evitar o corregir este problema, los métodos tales como detwinning, donde los cristales se separan físicamente, se han desarrollado. El aparejamiento puede también ser prevenido optimizando el largo del fragmento de la proteína que puede llevar a la formación de cristales untwinned. Sin embargo, este método requiere mucho tiempo. Microseeding por lo tanto ofrece una opción viable, barata.

Microseeding comparado con macroseeding

El sembrador es un método potente para la nucleación y el incremento de cristales. Puede ser dividido en dos clases: el macroseeding y el microseeding. Macroseeding refiere a la transferencia de un único cristal del μm de la talla 5-50 para iniciar el proceso de la cristalización. Mientras que en microseeding, las semillas submicroscópicas se utilizan para iniciar el proceso de la cristalización.

En microseeding, los cristales untwinned se utilizan como semillas y se ponen en las gotitas que se traen en un estado del equilibrio en los niveles inferiores de la sobresaturación. Este método puede generar diversas estructuras cristalinas y también se utiliza para perfeccionar la reproductibilidad de la cristalización.

En un estudio publicado en 2016, los investigadores usados hermanaron cristales de LigM como la semilla para el proceso de microseeding. Después del proceso de la optimización, los cristales untwinned podían ser generados. Microseeding por lo tanto fue mirado como método simple para superar el problema del aparejamiento en cristalografía.

Protocolo de Microseeding

Preparación de las existencias de semilla

Primero, los cristales se lavan para quitar la presencia de cualquier precipitado amorfo. Los cristales restantes entonces son estabilizados por la suspensión en una solución de no-disolución del precipitante. El todo el proceso se realiza en una temperatura en la cual los cristales no disuelvan. Posteriormente, los cristales se machacan en un homogeneizador de cristal y se salva esto hasta que esté necesitada. Otros métodos para pulverizar o para romper las semillas incluyen usando homogeneizadores del tejido, la sonicación, vortexing, molduras de las semillas, las varillas de cristal, el etc.

Dilución serial

Las semillas entonces en serie se diluyen tales que una dilución final es telemetría alcanzada de 1:1000 al 1:10,000,000. La dilución se realiza usando la solución del precipitante que se estabiliza. Aunque la fabricación de existencias en serie diluidas de la semilla sea un sembrador más cuantitativo, pero rayas es el método más fácil y más rápido para la transferencia de la semilla. El sembrador de la raya es hecho simple pasando una varilla fina recubierta con los cristales de semilla a través de la gotita.

Sembrador de proceso

Las caídas preequilibradas se rayan usando las semillas de diversas diluciones. La concentración del precipitante debe ser reducida en caso de que la nucleación sea independiente de la dilución. Sin embargo, si el número de cristales disminuye, esto puede ser dirigida aumentando la concentración de precipitante en las semillas.

Desventajas de microseeding

Aunque la cristalización se utilice para recuperar las proteínas puras de un caldo impuro de la fermentación, este método puede no trabajar en caso de que la solución de la proteína no sea pura. La pureza de la solución de la proteína es uno de los factores determinantes críticos para un resultado exitoso de este método.

En un estudio, los investigadores observaban el efecto de la solución de la proteína contaminado con una proteína estructural sin relación o estructural proteína similar. Encontraron que cualquier clase de contaminación podría obstaculizar el proceso sembrado.

Fuentes

Further Reading

Last Updated: May 1, 2019

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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