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Immunohistochemistry multicolore (IHC)

Il immunohistochemistry multicolore (IHC) è una tecnica usata per macchiare gli antigeni multipli all'interno di una sezione del tessuto. I kit tipici sono progettati per gli obiettivi tre o più differenti e sono usati per determinare l'organizzazione spaziale delle molecole particolari all'interno dei tessuti sani e malati.

Tessuti fluorescenti macchiati facendo uso delle tecniche di IHC - da Carl Du PontCarl Du Pont | Shutterstock

Principi di IHC multicolore

Il Immunohistochemistry è comunemente usato prevedere la distribuzione di una componente dell'obiettivo e della sua intensità. La routine IHC è limitata dal numero dei colori che possono essere usati, significante che le sezioni multiple devono essere catturate, macchiate e sovrapposte. Ciò non è sempre possibile, per esempio, se c'è soltanto un piccolo campione disponibile o una mancanza di tempo.

IHC multicolore risolve questo problema e permette la visualizzazione dell'architettura del tessuto, la distribuzione spaziale delle componenti cellulari ed i segnali co-espressi. L'immunofluorescenza è stata un metodo favorito per individuare parecchi indicatori in un tessuto, ma a differenza di IHC multicolore, non è permanente. Ciò permette che i ricercatori rivisitino ripetutamente i campioni senza cambiare i risultati di macchiatura. IHC può anche mostrare gli indicatori riguardante la morfologia completa del tessuto.

Tipi di IHC multicolori

Ci sono una serie di tipi di IHC multicolori, compreso microscopia di fluorescenza e del brightfield. La microscopia di Brightfield rappresenta un modulo elementare di microscopia che richiede i cromogeni o le paia degli enzimi da depositare per IHC multicolore. Ciò è sufficiente per la distinzione dei tipi delle cellule, ma è meno adatta per la caratterizzazione intracellulare. Le tinture di Counterstaining possono essere usate per migliorare multicolore nella microscopia del brightfield, quale verde metilico.

Uno dei punti principali con questo tipo di IHC multicolore è di assicurarsi che gli enzimi non attraversino reagiscano. Come conseguenza di questo, i protocolli sono solitamente ad alto contenuto di manodopera ed hanno il rischio di sovrapposizione di colori. La praticità di superamento dei tre colori differenti è limitata.

La microscopia di fluorescenza è un po'più complessa e nelle registrazioni di contesto di IHC i picchi spettrali differenti di indicatore luminoso contro uno sfondo scuro, poichè i fluorophores nei campioni sono eccitati da una lunghezza d'onda.

IHC conta sul legame di un anticorpo ad un antigene di interesse e può essere effettuato con un trattamento diretto o indiretto. Nella fluorescenza diretta, un fluorophore è coniugato direttamente ad un anticorpo primario, mentre nella fluorescenza indiretta, il fluorophore è coniugato ad un anticorpo che è specifico per l'anticorpo primario.

Parecchi fluorophores sono disponibili per IHC, oltre ai nanocrystals sviluppati di recente del punto di quantum che hanno picchi più stretti dell'emissione, significanti che c'è meno sovrapposizione. Tuttavia, gli insiemi filtro dall'emissione/di eccitazione possono limitare fisicamente l'abilità per IHC multicolore. Tipicamente, è gli insiemi del filtro che limitano gli indicatori fluorophore a tre colori, ma questo può essere emendato per includere più.

Come IHC multicolore si applica nella ricerca?

La fluorescenza IHC multicolore con quattro fluorophores differenti si è applicata per esaminare quella l'ambiente del tumore nel cancro gastrico. Ciò ha usato il metodo di contrassegno indiretto suddetto, a sua volta, applifying il segnale dell'obiettivo.

Inoltre, la capacità di visualizzare parecchi controlli immuni in un tessuto cancerogeno può delucidare simultaneamente i loro profili di espressione sulle celle immuni e su altre celle all'interno di un tumore.

Per concludere, prevedere l'co-espressione delle molecole di segnalazione può essere importante per la promozione della nostra comprensione del ciclo cellulare. La natura temporanea del ciclo cellulare recentemente ha ricevuto l'attenzione e l'opportunità di catturare simultaneamente questi indicatori del ciclo cellulare può contribuire a delucidare i comandi della progressione del ciclo.

Prospettive future

Malgrado è i successi, IHC multicolore viene con le sue proprie limitazioni. Con i colori aumentati in una sezione del tessuto, i campioni possono essere difficili da interpretare il mescolamento dato dei colori, come spesso accade perché la fluorescenza è usata spesso. Alcuni tipi di ICH multicolori egualmente portano il rischio di autofluorescence dal tessuto stesso, che rende la valutazione visiva in qualche modo difficile.

È stato suggerito che la microscopia di scansione confocale del laser potesse essere usata, pricipalmente per quantificare il presente della fluorescenza. La microscopia spettrale di questo genere può individuare indipendente le gamme di parecchi indicatori, che li impedisce mescolarsi. Questa procedura specifica si è applicata al tessuto della tonsilla, con cinque colori differenti.

Sorgenti

Last Updated: Jan 3, 2019

Sara Ryding

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Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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