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PCR multipla

La reazione a catena della polimerasi (PCR) è un metodo molecolare che è impiegato per l'amplificazione in vitro di una regione specifica in un filo di acido desossiribonucleico (DNA). La PCR multipla comprende l'amplificazione e l'ordinamento dell'parecchi frammenti di DNA in una singola reazione.

Profilo fluorescente di PCR della multisalaCredito di immagine: Nikolay Chaban/Shutterstock

La PCR multipla aiuta nella rilevazione simultanea dei microrganismi multipli (particolarmente quelli che possono causare le sindromi cliniche identiche o simili) ed è utilizzata in una serie di laboratorio e metodi clinici quale impronta genetica, Diagnosi della mutazione genetica ed in altre aree della genetica molecolare.

Ottimizzazione del trattamento di PCR della multisala

Nella PCR della multisala, le mani di fondo sequenza-specifiche provocano l'amplificazione delle regioni uniche del DNA (sia nelle diverse paia che nelle combinazioni della mano di fondo) all'interno di singola reazione.

La pianificazione strategica ed i tentativi multipli dell'ottimizzazione sono solitamente un presupposto per lo sviluppo di efficace PCR della multisala. Una riuscita analisi richiede una mano di fondo, una concentrazione ottimale di buffer di PCR ed il bilanciamento corretto dei deoxynucleotides e del cloruro di magnesio.

Per l'amplificazione, la reazione richiede, quantità adeguata di DNA polimerasi termostabile (vale a dire DNA polimerasi di Taq [aquaticus di Thermus]) e DNA del modello come pure le temperature di riciclaggio programmate.

Alcune delle considerazioni importanti di progettazione per una mano di fondo utilizzata nella PCR della multisala sono lunghezza della mano di fondo, la temperatura di fusione, specificità della mano di fondo e controllo della formazione di dimeri della mano di fondo. Una lunghezza ideale della mano di fondo è fra la coppia di basi 18-22.

Una temperatura fra 50-60° Celsius è preferita e la cura dovrebbe essere catturata che i dimeri della mano di fondo non sono formati. I dimeri della mano di fondo possono piombo all'amplificazione inutile. La specificità della mano di fondo è di importanza uguale poichè ci potrebbero essere sequenze multiple dell'obiettivo in un'imbarcazione della reazione.

I protocolli multipli di PCR richiedono spesso l'aggiunta di fino a 10 paia differenti della mano di fondo di PCR all'interno della stessa miscela di reazione.

Per facilitare questo, le mani di fondo estese egualmente sono utilizzate (per esempio 28 nucleotidi rispetto ai 18-22 nucleotidi usuali) per migliorare la specificità della mano di fondo ed impedire le interazioni indesiderate di ricottura fra le mani di fondo.

Scelta dell'analisi giusta

Ci sono molti kit di PCR della multisala disponibili nel servizio che pretendono di essere pronti per usare e che non richiedono l'ottimizzazione.

Sebbene questi kit contengano la giusta quantità di reagenti quali i buffer, le DNA polimerasi, o i trifosfati di deoxyribonucleotide, è di importanza fondamentale da ottimizzare la concentrazione di mani di fondo e di circostanze thermocycling per raggiungere le reazioni stabili ed equilibrate.

La convalida e la valutazione meticolose di tutta la nuova procedura di PCR della multisala è cruciali. Ove possibile, i comandi esterni ed interni di qualità dovrebbero applicarsi diligente.

Nell'occuparsi dei sistemi multipli novelli, il numero minimo dei modelli che sono necessari per l'amplificazione positiva dovrebbe essere usato.

La specificità di un'analisi dovrebbe essere regolato ed ottimizzato secondo il requisito di studio. Per ottenere il risultato voluto, i ricercatori suggeriscono l'uso di una quantità conosciuta di DNA (totale) estratto dell'organismo dell'obiettivo come modello.

Applicazioni della PCR della multisala

La PCR multipla ha trovato la sua applicazione nell'analisi delle mutazioni e eliminazione del gene, l'identificazione dell'agente patogeno, singolo polimorfismo del nucleotide (SNP) che genotyping, studio di RNA e negli studi legali.

Recentemente, questa tecnica è stata impiegata frequentemente per esaminare la genetica di popolazione, per tenere la carreggiata uno scoppio di malattia in una comunità, nell'identificazione molecolare di specie, per valutare le interazioni trofiche come pure nella sicurezza alimentare.

Il vasto potenziale della PCR della multisala egualmente è rispecchiato nei numeri in continuo aumento delle pubblicazioni scientifiche e pratiche che hanno adottato con successo questo metodo.

Sorgenti:

  • https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11835531
  • https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3573865/
  • https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1198743X17306493
  • van Cuoio-Verkuil E, van Belikum A, rivolta il fieno il JP. Principi e aspetti tecnici di amplificazione di PCR. Media di scienza & di affari di Springer, 2008; pp. 63-90.
  • http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/multiplex-pcr.html

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Last Updated: Feb 26, 2019

Dr. Tomislav Meštrović

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Dr. Tomislav Meštrović

Dr. Tomislav Meštrović is a medical doctor (MD) with a Ph.D. in biomedical and health sciences, specialist in the field of clinical microbiology, and an Assistant Professor at Croatia's youngest university - University North. In addition to his interest in clinical, research and lecturing activities, his immense passion for medical writing and scientific communication goes back to his student days. He enjoys contributing back to the community. In his spare time, Tomislav is a movie buff and an avid traveler.

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