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PCR multiplex

A reacção em cadeia da polimerase (PCR) é um método molecular que seja empregado para in vitro a amplificação de uma região específica em uma costa do ácido deoxyribonucleic (ADN). O PCR multiplex envolve a amplificação e arranjar em seqüência do diversos fragmentos do ADN em uma única reacção.

Perfil fluorescente do PCR do multiplexCrédito de imagem: Nikolay Chaban/Shutterstock

O PCR multiplex ajuda na detecção simultânea de micro-organismos múltiplos (especialmente aqueles que podem causar síndromes clínicas idênticas ou similares) e é usado em um número laboratório e de métodos clínicos tais como o fingerprinting de ADN, diagnóstico da mutação genética, e em outras áreas de genéticas moleculars.

Aperfeiçoando o processo multiplex do PCR

No PCR multiplex, as primeiras demão seqüência-específicas conduzem à amplificação de regiões originais do ADN (em pares individuais e em combinações da primeira demão) dentro de uma única reacção.

O planeamento estratégico e as tentativas múltiplas da optimização são geralmente uma condição prévia para a revelação de um PCR eficaz do multiplex. Um ensaio bem sucedido exige uma primeira demão, uma concentração óptima de amortecedor do PCR e o balanço correcto dos deoxynucleotides e do cloreto do magnésio.

Para a amplificação, a reacção exige, uma quantidade adequada de uma polimerase de ADN thermostable (a saber polimerase de ADN de Taq [aquaticus de Thermus]), e ADN do molde, assim como temperaturas do ciclismo programado.

Algumas das considerações importantes do projecto para uma primeira demão usada no PCR multiplex são comprimento da primeira demão, temperatura de derretimento, especificidade da primeira demão, e controle da formação de dímero da primeira demão. Um comprimento ideal da primeira demão está entre 18-22 pares baixos.

Uma temperatura entre 50-60° Celsius é preferida e deve ser tomado que os dímero da primeira demão não estão formados. Os dímero da primeira demão podem conduzir à amplificação desnecessária. A especificidade da primeira demão é da importância igual porque poderia haver umas seqüências múltiplas do alvo em uma embarcação da reacção.

Os protocolos multiplex do PCR exigem frequentemente a adição de até 10 pares diferentes da primeira demão do PCR dentro da mesma mistura de reacção.

Para facilitar isto, as primeiras demão prolongadas são usadas igualmente (por exemplo 28 nucleotides ao contrário dos 18-22 nucleotides usuais) a fim melhorar a especificidade da primeira demão e impedir interacções indesejáveis do recozimento entre primeiras demão.

Escolhendo o ensaio direito

Há muitos jogos multiplex do PCR disponíveis no mercado que sentido ser operacional e que não exigem nenhuma optimização.

Embora estes jogos contenham a quantidade direita de reagentes tais como amortecedores, polimerases de ADN, ou triphosphates do deoxyribonucleotide, é imperativo aperfeiçoar a concentração de primeiras demão e de circunstâncias thermocycling a fim conseguir reacções estáveis e equilibradas.

A validação e a avaliação meticulosas de todo o procedimento novo do PCR do multiplex são cruciais. Na medida do possível, os controles externos e internos da qualidade devem diligently ser aplicados.

Ao tratar os sistemas multiplex novos, o número mínimo de moldes que são necessários para a amplificação positiva deve ser usado.

A especificidade de um ensaio deve ser ajustada e aperfeiçoado conforme a exigência do estudo. Para obter o resultado desejado, os pesquisadores sugerem o uso de uma quantidade conhecida de ADN (total) extraído do organismo do alvo como um molde.

Aplicações do PCR multiplex

O PCR multiplex encontrou sua aplicação na análise das mutações e o supressão do gene, a identificação do micróbio patogénico, único polimorfismo do nucleotide (SNP) que genotyping, estudo do RNA e em estudos judiciais.

Recentemente, esta técnica foi empregada freqüentemente para examinar a genética de população, para seguir uma manifestação da doença em uma comunidade, na identificação molecular da espécie, para avaliar interacções tróficos, assim como na segurança alimentar.

O potencial largo do PCR multiplex é espelhado igualmente nos números crescentes de publicações científicas e práticas que adotaram com sucesso este método.

Fontes:

  • https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11835531
  • https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3573865/
  • https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1198743X17306493
  • camionete Pele-Verkuil E, camionete Belikum Um, faz feno o JP. Princípios e aspectos técnicos da amplificação do PCR. Media da ciência & do negócio de Springer, 2008; pp. 63-90.
  • http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/multiplex-pcr.html

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Last Updated: Feb 26, 2019

Dr. Tomislav Meštrović

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Dr. Tomislav Meštrović

Dr. Tomislav Meštrović is a medical doctor (MD) with a Ph.D. in biomedical and health sciences, specialist in the field of clinical microbiology, and an Assistant Professor at Croatia's youngest university - University North. In addition to his interest in clinical, research and lecturing activities, his immense passion for medical writing and scientific communication goes back to his student days. He enjoys contributing back to the community. In his spare time, Tomislav is a movie buff and an avid traveler.

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