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Polimerización en cadena múltiplex

La reacción en cadena de polimerasa (PCR) es un método molecular que se emplea para la amplificación in vitro de una región específica en un cabo del ácido desoxirribonucléico (DNA). La polimerización en cadena múltiplex implica la amplificación y la secuencia de varios fragmentos de la DNA en una única reacción.

Perfil fluorescente de la polimerización en cadena del múltiplexHaber de imagen: Nikolay Chaban/Shutterstock

La polimerización en cadena múltiplex ayuda en la detección simultánea de los microorganismos múltiples (especialmente ésos que pueden causar síndromes clínicos idénticos o similares) y se utiliza en vario laboratorio y métodos clínicos tales como huella dactilar genética, Diagnosis de la mutación genética, y en otras áreas de genéticas moleculares.

Optimización del proceso múltiplex de la polimerización en cadena

En la polimerización en cadena múltiplex, las pinturas de fondo serie-específicas dan lugar a la amplificación de las regiones únicas de la DNA (en pares individuales y en combinaciones de la pintura de fondo) dentro de una única reacción.

La formulación de planes estratégica y las tentativas múltiples de la optimización son generalmente un requisito previo para el revelado de una polimerización en cadena efectiva del múltiplex. Un análisis acertado requiere una pintura de fondo, una concentración óptima de almacenador intermedio de la polimerización en cadena y el equilibrio correcto de deoxynucleotides y del cloruro del magnesio.

Para la amplificación, la reacción requiere, cantidad adecuada de una polimerasa de DNA termoestable (a saber polimerasa de DNA de Taq [aquaticus de Thermus]), y DNA del patrón, así como las temperaturas de ciclaje programadas.

Algunas de las consideraciones importantes del diseño para una pintura de fondo usada en la polimerización en cadena múltiplex son largo de la pintura de fondo, temperatura que funde, especificidad de la pintura de fondo, y mando de la formación de dimeros de la pintura de fondo. Un largo ideal de la pintura de fondo está entre 18-22 pares bajos.

Una temperatura entre 50-60° Celsius se prefiere y el cuidado debe ser tomado que los dimeros de la pintura de fondo no están formados. Los dimeros de la pintura de fondo pueden llevar a la amplificación innecesaria. La especificidad de la pintura de fondo es de importancia igual pues podría haber series de objetivos múltiples en un buque de la reacción.

Los protocolos múltiplexes de la polimerización en cadena requieren a menudo la adición de hasta 10 diversos pares de la pintura de fondo de la polimerización en cadena dentro de la misma mezcla de reacción.

Para facilitar esto, las pinturas de fondo extendidas también se utilizan (e.g. 28 nucleótidos en comparación con los 18-22 nucleótidos usuales) para perfeccionar especificidad de la pintura de fondo y prevenir acciones recíprocas indeseadas de la esmaltación entre las pinturas de fondo.

Elegir el análisis correcto

Hay muchos estuches múltiplexes de la polimerización en cadena disponibles en el mercado que pretenden ser prontos para usar y que no requieren ninguna optimización.

Aunque estos estuches contengan la cantidad correcta de reactivos tales como almacenadores intermedios, polimerasas de DNA, o trifosfatos del deoxyribonucleotide, es imprescindible optimizar la concentración de pinturas de fondo y de condiciones thermocycling para lograr reacciones estables y equilibradas.

La validación y la evaluación meticulosas de cualquier nuevo procedimiento de la polimerización en cadena del múltiplex es cruciales. Donde sea posible, los mandos externos e internos de la calidad deben ser aplicados diligente.

Al ocuparse de los sistemas múltiplexes nuevos, el número mínimo de patrones que sean necesarios para la amplificación positiva debe ser utilizado.

La especificidad de un análisis se debe ajustar y optimizar según el requisito del estudio. Para conseguir el resultado deseado, los investigadores sugieren el uso de una cantidad sabida de DNA (total) extraída del organismo del objetivo como patrón.

Usos de la polimerización en cadena múltiplex

La polimerización en cadena múltiplex ha encontrado su uso en el análisis de mutaciones y supresión del gen, identificación el patógeno, único polimorfismo del nucleótido (SNP) genotyping, estudio del ARN y en estudios forenses.

Recientemente, esta técnica se ha empleado con frecuencia para examinar genética de población, para rastrear un brote de la enfermedad en una comunidad, en la identificación molecular de la especie, para valorar acciones recíprocas tróficas, así como en seguridad alimentaria.

El potencial amplio de la polimerización en cadena múltiplex también se refleja en los números cada vez mayores de publicaciones científicas y prácticas que han adoptado con éxito este método.

Fuentes:

  • https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11835531
  • https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3573865/
  • https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1198743X17306493
  • van Piel-Verkuil E, van Belikum A, hace heno JP. Principios y aspectos técnicos de la amplificación de la polimerización en cadena. Ambientes de la ciencia y del asunto del saltador, 2008; págs. 63-90.
  • http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/multiplex-pcr.html

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Last Updated: Feb 26, 2019

Dr. Tomislav Meštrović

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Dr. Tomislav Meštrović

Dr. Tomislav Meštrović is a medical doctor (MD) with a Ph.D. in biomedical and health sciences, specialist in the field of clinical microbiology, and an Assistant Professor at Croatia's youngest university - University North. In addition to his interest in clinical, research and lecturing activities, his immense passion for medical writing and scientific communication goes back to his student days. He enjoys contributing back to the community. In his spare time, Tomislav is a movie buff and an avid traveler.

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