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Tache du nord/tache d'ARN

Introduction

La première technique épongeante développée par M. Edwin Southern est appelée la tache du sud. Cette technique a été par la suite modifiée afin de trouver d'autres molécules-cible. Ces techniques étant des variations de tache du sud ont été nommées tache du nord, tache occidentale, et tache orientale. La tache du nord est employée pour trouver des séquences d'ARN spécifiques dans un échantillon. Par conséquent elle est également appelée la tache d'ARN.

Pimp your brain: Northern Blot

Principe

Dans la tache du nord, l'ARN témoin est séparé sur la base de la taille avec l'aide de l'électrophorèse en gel. Les éclats séparés d'ARN sont transférés à une membrane de support et puis traités avec une sonde ADN marquée. Si l'échantillon contient la séquence d'ARN complémentaire, la sonde grippera à la membrane et elle peut être conçue suivre des méthodes variées.

Procédure

Les opérations principales dans la technique du nord de tache sont comme suit :

  • L'échantillon d'ARN est d'abord séparé par taille utilisant l'électrophorèse en gel d'agarose. La forme de molécules d'ARN strie plutôt que des bandes sur le gel car il y a plusieurs petits éclats d'ARN.
  • Les molécules d'ARN sont alors transférées à un buvard spécial habituellement fait de nitrocellulose. Des membranes composées du nylon peuvent également être utilisées. La configuration de séparation des molécules d'ARN dans le buvard demeure la même que celle dans le gel.
  • La tache est alors exposée à une sonde ADN marquée et monocatenaire. Les bases dans cette sonde appareilleront avec leurs séquences d'ARN complémentaires dans la tache produisant une molécule bicaténaire de DNA-RNA. Bien que la sonde ne puisse pas être vue à ce stade, puisqu'elle est marquée avec de l'enzyme ou la balise radioactive, il peut voir après le traitement adapté dans la prochaine opération.
  • Ensuite, la sonde est exposée à un substrat sans couleur qui obtient converti par l'enzyme en produit coloré et est visible sur un film radiographique. Au cas où la sonde serait radioactive, il peut directement voir sur le film radiographique.  

Applications

Certaines des applications principales du transfert de Northern sont cotées ci-dessous :

  • L'expression du gène étudie - pour observer l'overexpression des gènes de cancérigène et de l'expression du gène en cas de rejet de greffe
  • Dans le diagnostic de plusieurs maladies, par exemple, maladie de Crohn
  • Pour le dépistage des microRNAs viraux qui jouent des fonctions clé dans le viral infection
  • Pour examiner des recombinants - en trouvant l'ARNm a formé par le transgène

Limitations de tache du nord

Quelques limitations de la technique du nord de tache sont discutées ci-dessous :

  • La méthode du nord normale de tache a la sensibilité inférieure si comparée à cela du RT-PCR et des analyses de protection de nucléase.
  • La technique exige un grand nombre de séquence d'échantillon d'ARN d'objectif tandis que des techniques plus neuves comme le RT-PCR en temps réel ont besoin seulement d'une copie unique d'ARN pour l'amplification.
  • La technique du nord de tache est très sensible même à la légère dégradation des échantillons d'ARN. La dégradation affecte rigoureusement la qualité des données et la quantitation.
  • La technique devient laborieuse dans les cas où des sondes multiples doivent être ajoutées. Une deuxième sonde peut être ajoutée au système seulement après retirer la première sonde complet. Ceci peut rendre le procédé hautement complexe. Après le traitement du système avec les produits chimiques brutaux pour retirer la première sonde, l'exactitude des caractéristiques des ronds suivants peut également être compromise.
  • La tache du nord peut seulement mesurer des régimes équilibrés d'accumulation d'ARNm et pas de stabilité ou de transcription d'ARN.

Résumé

La technique du nord de tache est une voie classique d'analyser la présence d'une séquence d'ARN spécifique dans un échantillon. Le transfert de Northern est relativement bon marché et simple pour exécuter dans le laboratoire. Les avancements récents dans les tampons et des membranes d'hybridation ont activé éponger élevé de sensibilité. Cependant, les découvertes en technologie d'ACP ces derniers temps ont activé une identification ainsi qu'une quantitation beaucoup plus simples, plus rapides, et précises d'ARN.

Références

Further Reading

Last Updated: Aug 23, 2018

Susha Cheriyedath

Written by

Susha Cheriyedath

Susha has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Chemistry and Master of Science (M.Sc) degree in Biochemistry from the University of Calicut, India. She always had a keen interest in medical and health science. As part of her masters degree, she specialized in Biochemistry, with an emphasis on Microbiology, Physiology, Biotechnology, and Nutrition. In her spare time, she loves to cook up a storm in the kitchen with her super-messy baking experiments.

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