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Macchia nordica/macchia del RNA

Introduzione

La prima tecnica macchiante sviluppata dal Dott. Edwin Southern è chiamata la macchia del sud. Questa tecnica successivamente è stata modificata in modo da individuare altre molecole dell'obiettivo. Queste tecniche che sono le variazioni della macchia del sud sono state nominate macchia nordica, macchia occidentale e macchia orientale. La macchia nordica è usata per individuare le sequenze specifiche del RNA in un campione. Di conseguenza egualmente è chiamato la macchia del RNA.

Pimp your brain: Northern Blot

Principio

Nella macchia nordica, il RNA del campione è separato in base alla dimensione con l'aiuto dell'elettroforesi del gel. I frammenti separati del RNA sono trasferiti ad una membrana di sostegno e poi sono trattati con una sonda contrassegnata del DNA. Se il campione contiene la sequenza complementare del RNA, la sonda legherà alla membrana e può essere visualizzata facendo uso di vari metodi.

Procedura

I punti chiave nella tecnica nordica della macchia sono come segue:

  • Il campione del RNA in primo luogo è separato dalla dimensione facendo uso dell'elettroforesi del gel di agarosio. Il modulo delle molecole del RNA si stria piuttosto che le bande sul gel poichè ci sono parecchi piccoli frammenti di RNA.
  • Le molecole del RNA poi sono trasferite ad una carta assorbente speciale fatta solitamente di nitrocellulosa. Le membrane composte di nylon possono anche essere utilizzate. Il reticolo della separazione delle molecole del RNA nella carta assorbente rimane lo stesso di quello nel gel.
  • La macchia poi è esposta ad una sonda contrassegnata e unico incagliata del DNA. Le basi su questa sonda accoppieranno con le loro sequenze complementari del RNA nella macchia producendo una molecola a doppia elica di DNA-RNA. Sebbene la sonda non possa essere veduta in questa fase, poiché è contrassegnata con un enzima o un tag radioattivo, può essere veduto dopo il trattamento appropriato al punto seguente.
  • Dopo, la sonda è esposta ad un substrato incolore che ottiene convertito dall'enzima in prodotto colorato ed è visibile su una lastra radioscopica. Nel caso la sonda sia radioattiva, può direttamente essere veduto sulla lastra radioscopica.  

Applicazioni

Alcune delle applicazioni chiave di macchiare nordico sono elencate qui sotto:

  • L'espressione genica studia - per osservare la sovraespressione dei geni cancerogeni e dell'espressione genica nel caso del rigetto
  • Nella diagnosi di parecchie malattie, per esempio, morbo di Crohn
  • Per rilevazione dei microRNAs virali che svolgono i ruoli chiave nell'infezione virale
  • per schermare i recombinants - individuando il mRNA si è formato dal transgene

Limitazioni della macchia nordica

Alcune limitazioni della tecnica nordica della macchia sono discusse qui sotto:

  • Il metodo nordico standard della macchia ha sensibilità più bassa una volta confrontato a quella di RT-PCR e delle analisi della protezione della nucleasi.
  • La tecnica richiede un gran numero di sequenza del campione del RNA dell'obiettivo mentre le più nuove tecniche come RT-PCR in tempo reale hanno bisogno soltanto di singola copia di RNA per l'amplificazione.
  • La tecnica nordica della macchia è molto sensibile anche a leggera degradazione dei campioni del RNA. La degradazione drasticamente pregiudica la qualità e la quantificazione di dati.
  • La tecnica diventa laboriosa nei casi in cui le sonde multiple devono aggiungersi. Una seconda sonda può aggiungersi al sistema solo dopo l'eliminazione della prima sonda completamente. Ciò può rendere il trattamento altamente complesso. Dopo il trattamento del sistema con i prodotti chimici duri per eliminare la prima sonda, l'accuratezza dei dati dai giri successivi può anche essere compromessa.
  • La macchia nordica può misurare soltanto le tariffe di capitalizzazione del mRNA dello stato di stabilità e non della stabilità o della trascrizione del RNA.

Riassunto

La tecnica nordica della macchia è un modo classico di analizzare la presenza di sequenza specifica del RNA in un campione. Macchiare nordico è relativamente economico e semplice eseguire in laboratorio. Gli avanzamenti recenti in buffer e membrane di ibridazione hanno permesso ad alto macchiare della sensibilità. Tuttavia, le innovazioni nella tecnologia di PCR recentemente hanno permesso ad un'identificazione come pure ad una quantificazione molto più semplici, più rapide e precise di RNA.

Riferimenti

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Last Updated: Aug 23, 2018

Susha Cheriyedath

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Susha Cheriyedath

Susha has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Chemistry and Master of Science (M.Sc) degree in Biochemistry from the University of Calicut, India. She always had a keen interest in medical and health science. As part of her masters degree, she specialized in Biochemistry, with an emphasis on Microbiology, Physiology, Biotechnology, and Nutrition. In her spare time, she loves to cook up a storm in the kitchen with her super-messy baking experiments.

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