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Mancha do norte/mancha do RNA

Introdução

A primeira técnica de mancha desenvolvida pelo Dr. Edwin Do sul é chamada a mancha do sul. Esta técnica foi alterada subseqüentemente para detectar outras moléculas do alvo. Estas técnicas que são variações da mancha do sul foram nomeadas mancha do norte, mancha ocidental, e mancha oriental. A mancha do norte é usada para detectar seqüências específicas do RNA em uma amostra. Conseqüentemente é chamado igualmente a mancha do RNA.

Pimp your brain: Northern Blot

Princípio

Na mancha do norte, o RNA da amostra é separado com base no tamanho com a ajuda da electroforese do gel. Os fragmentos separados do RNA são transferidos a uma membrana do apoio e tratados então com uma ponta de prova etiquetada do ADN. Se a amostra contem a seqüência complementar do RNA, a ponta de prova ligará à membrana e pode ser visualizada usando vários métodos.

Procedimento

As etapas chaves na técnica do norte da mancha são como segue:

  • A amostra do RNA é separada primeiramente pelo tamanho usando a electroforese do gel do agarose. O formulário das moléculas do RNA lista um pouco do que faixas no gel porque há diversos fragmentos pequenos do RNA.
  • As moléculas do RNA são transferidas então a um papel de mancha especial feito geralmente da nitrocelulose. As membranas compo do nylon podem igualmente ser usadas. O teste padrão da separação das moléculas do RNA no papel de mancha permanece o mesmo que aquele no gel.
  • A mancha é expor então a uma ponta de prova etiquetada, único-encalhada do ADN. As bases nesta ponta de prova emparelhar-se-ão com suas seqüências complementares do RNA na mancha produzindo uma molécula dobro-encalhada de DNA-RNA. Embora a ponta de prova não possa ser considerada nesta fase, desde que é etiquetada com uma enzima ou uma etiqueta radioactiva, pode-se ver após o tratamento apropriado no passo seguinte.
  • Em seguida, a ponta de prova é expor a uma carcaça incolor que obtenha convertida pela enzima a um produto colorido e é visível em um filme de raio X. Caso que a ponta de prova é radioactiva, pode-se directamente ver no filme de raio X.  

Aplicações

Algumas das aplicações chaves da mancha do norte estão listadas abaixo:

  • A expressão genética estuda - para observar o overexpression de genes cancerígenos e de expressão genética em caso da rejeção da transplantação
  • No diagnóstico de diversas doenças, por exemplo, a doença de Crohn
  • Para a detecção de microRNAs virais que jogam os papéis chaves na infecção viral
  • Para seleccionar recombinants - detectando o mRNA formou pelo transgene

Limitações da mancha do norte

Algumas limitações da técnica do norte da mancha são discutidas abaixo:

  • O método do norte padrão da mancha tem uma mais baixa sensibilidade quando comparado àquela de RT-PCR e de ensaios da protecção da nuclease.
  • A técnica exige uma grande quantidade de seqüência da amostra do RNA do alvo quando umas técnicas mais novas como o tempo real RT-PCR precisarem somente uma única cópia do RNA para a amplificação.
  • A técnica do norte da mancha é muito sensível mesmo à degradação ligeira das amostras do RNA. A degradação afecta dràstica a qualidade e a quantificação dos dados.
  • A técnica torna-se laboriosa nos casos onde as pontas de prova múltiplas precisam de ser adicionadas. Uma segunda ponta de prova pode ser adicionada ao sistema somente depois a remoção da primeira ponta de prova completamente. Isto pode fazer o processo altamente complexo. Após ter tratado o sistema com os produtos químicos ásperos para remover a primeira ponta de prova, a precisão dos dados dos círculos subseqüentes pode igualmente ser comprometida.
  • A mancha do norte pode somente medir taxas de estado estacionário da acumulação do mRNA e não da estabilidade ou da transcrição do RNA.

Sumário

A técnica do norte da mancha é uma maneira clássica de analisar a presença de uma seqüência específica do RNA em uma amostra. A mancha do norte é relativamente barata e simples executar no laboratório. Os avanços recentes nos amortecedores e nas membranas da hibridação permitiram a mancha alta da sensibilidade. Contudo, as descobertas na tecnologia do PCR recentemente permitiram uma identificação assim como uma quantificação muito mais simples, mais rápidas, e precisas do RNA.

Referências

Further Reading

Last Updated: Aug 23, 2018

Susha Cheriyedath

Written by

Susha Cheriyedath

Susha has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Chemistry and Master of Science (M.Sc) degree in Biochemistry from the University of Calicut, India. She always had a keen interest in medical and health science. As part of her masters degree, she specialized in Biochemistry, with an emphasis on Microbiology, Physiology, Biotechnology, and Nutrition. In her spare time, she loves to cook up a storm in the kitchen with her super-messy baking experiments.

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    Cheriyedath, Susha. (2018, August 23). Mancha do norte/mancha do RNA. News-Medical. Retrieved on September 26, 2021 from https://www.news-medical.net/life-sciences/Northern-Blot-RNA-Blot.aspx.

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