Synthèse de marquage d'acide nucléique

Des acides nucléiques (c.-à-d. ADN et ARN) peuvent être promptement marqués avec les balises variées qui activent leur dépistage et/ou purification. Ces marques peuvent alors être employées pour récupérer ou recenser d'autres molécules de interaction.

Tubes de pipette et dCrédit d'image : anyaivanova/Shutterstock

Une pléthore de produit chimique ou les méthodes enzymatiques sont procurables pour produire des acides nucléiques de ce type marqués avec des fluorophores, des enzymes et des phosphates radioactifs, ou des nucléotides modifiés avec le digoxygenin ou la biotine.

Des méthodes de Bioconjugation qui sont utilisées pour produire des sondes d'acide nucléique peuvent également être adaptées pour fixer les acides nucléiques à quelques autres surfaces ou molécules pour aider l'immobilisation ou la distribution visée.

Le choix d'une méthode optimale dépend en partie du degré exigé de marquage et en circuit si la modification peut produire les interactions désirées.

Le produit chimique et les méthodes enzymatiques existent pour produire de cela sont marqués au ′ 5 ou à l'extrémité de 3 ′ de l'oligonucléotide. Ces méthodes peuvent également être employées pour intégrer des sondes dans toute la séquence.

Quand le rétablissement à petite échelle de sonde est nécessaire, les méthodes enzymatiques présentent une approche économique. Cependant, les méthodes chimiques sont pertinentes pour la production à grande échelle.

Méthodes chimiques pour le marquage d'acide nucléique

Periodates sont des anions qui sont formés de l'oxygène et de l'iode, et sont couramment trouvés comme sels de sodium ou du potassium. Les groupes d'aldéhyde qui sont produits dans les solutions avec des periodates sont spontanément réactifs vers les surfaces ou les molécules amine-contenantes. Ainsi, l'oxydation de periodate de l'ARN est une méthode chimique courante pour le marquage d'acide nucléique.

Le carbodiimide la date d'achèvement prévue ou le 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) est un composé soluble dans l'eau qui est préférable employé dans des réactions aqueuses quand le pH est entre 4,0 et 6,0. la conjugaison Date d'achèvement-assistée est une approche économique pour l'ADN s'accouplant et l'ARN sur n'importe quelle surface amine-contenante primaire ou la molécule.

Le marquage chimique fait au hasard de l'ADN ou de l'ARN sur la longueur des acides nucléiques est également une méthode de marquage effectuée qui active un degré plus élevé de marquage si comparée aux techniques de extrémité-marquage.

Cependant, un désavantage du marquage fait au hasard de produit chimique est une modification directe des bases de nucléotide, qui réduit ou évite l'appareillement des bases entre les boucles complémentaires tandis que les expériences d'hybridation sont en cours. Par conséquent, l'équilibrage du degré de marquage avec le rendement d'hybridation de sonde dans quelques expériences spécifiques est réellement justifié.

Méthodes enzymatiques pour le marquage d'acide nucléique

L'ADN polymérase est une enzyme employée pour produire des polymères d'ADN par des procédés de prolonge d'allongement ou d'amorce d'ADN.

Ces enzymes sont employées pour produire des sondes d'acide nucléique en comportant fait au hasard les nucléotides modifiés pendant la réplication de l'ADN, spécialement par des procédures simples de prolonge d'amorce ou par des amplifications en chaîne par polymérase. De telles sondes montrent la spécificité élevée activant le dépistage même des quantités minutieuses de l'objectif.

La transférase terminale de deoxynucleotidyl (habituellement abrégée comme TdT) est une enzyme d'ADN polymérase qui est exprimée en certaines cellules lymphoïdes. Les sources habituelles des matrices d'ADN qui peuvent être modifiées avec TdT comprennent les amorces monocatenaires et non étiquetées (PCR) d'amplification en chaîne par polymérase, ainsi que la restriction bicaténaire d'endonucléase réduit en fragments avec 3' des porte-à-faux.

Une enzyme connue sous le nom de ligase de l'ARN T4 (une ligase ATP-dépendante) qui provient du bactériophage T4 catalyse l'adhérence entre un ′ de la borne 5 - phosphatez et un ′ de la borne 3 - groupe d'hydroxyle sur la molécule d'ARN.

En dépit du substrat primaire pour cette ligase spécifique étant ARN, les conditions de réaction peuvent être aussi bien optimisés pour des molécules d'ADN (plus particulièrement, molécules d'ADN monocatenaires), avec le rendement en quelque sorte inférieur.

Le polynucléotide kinase T4 (abrégé comme T4 PNK), également trouvé dans le bactériophage T4, aide dans le transfert un phosphate organique à partir de la molécule d'ATP au ′ 5 - groupe d'hydroxyle d'un acide nucléique. Cette enzyme est matrice indépendante et peut efficacement modifier 5 porte-à-faux de ′ et polynucléotides monocatenaires.

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Last Updated: Feb 26, 2019

Dr. Tomislav Meštrović

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Dr. Tomislav Meštrović

Dr. Tomislav Meštrović is a medical doctor (MD) with a Ph.D. in biomedical and health sciences, specialist in the field of clinical microbiology, and an Assistant Professor at Croatia's youngest university - University North. In addition to his interest in clinical, research and lecturing activities, his immense passion for medical writing and scientific communication goes back to his student days. He enjoys contributing back to the community. In his spare time, Tomislav is a movie buff and an avid traveler.

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