Generalità di contrassegno dell'acido nucleico

Gli acidi nucleici (cioè DNA e RNA) possono essere contrassegnati prontamente con i vari tag che permettono alla loro rilevazione e/o depurazione. Questi contrassegni possono poi essere usati per recuperare o identificare altre molecole d'interazione.

Tubi del eppendorf e della pipetta che contengono campione di DNA contrassegnato con la tintura rosa.Credito di immagine: anyaivanova/Shutterstock

Una pletora di metodi chimici o enzimatici è a disposizione per generare gli acidi nucleici come quelli contrassegnati con i fluorophores, enzimi e fosfati radioattivi, o nucleotidi modificati con digoxygenin o biotina.

I metodi di Bioconjugation che sono impiegati per la generazione delle sonde dell'acido nucleico possono anche adattarsi per fissare gli acidi nucleici ad alcune altre superfici o molecole per assistere l'immobilizzazione o la consegna mirata a.

La scelta del metodo ottimale dipende parzialmente dal grado richiesto di contrassegno e sopra se la modifica possa produrre le interazioni desiderate.

Sia i metodi chimici che enzimatici esistono per la generazione del quello sono contrassegnati al ′ 5 o all'estremità di 3 ′ dell'oligonucleotide. Questi metodi possono anche essere usati per integrare le sonde in tutto la sequenza.

Quando la generazione su scala ridotta della sonda è necessaria, i metodi enzimatici presentano un approccio economico. Tuttavia, i metodi chimici sono pertinenti per produzione del più grande disgaggio.

Metodi chimici per il contrassegno dell'acido nucleico

Periodates è anioni che sono formati da ossigeno e da iodio e comunemente è trovato come sali di sodio o di potassio. I gruppi dell'aldeide che sono creati nelle soluzioni con i periodates sono spontaneamente reattivi verso le superfici o le molecole ammina-contenenti. Quindi, l'ossidazione del periodate di RNA è un metodo chimico comune per il contrassegno dell'acido nucleico.

Il carbodiimide il EDC o 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) è un composto solubile in acqua che è utilizzato preferibilmente nelle reazioni acquose quando il pH è fra 4,0 e 6,0. la coniugazione EDC-mediata è un approccio economico per sia DNA che RNA a tutta la superficie ammina-contenente primaria o la molecola di coppia.

Il contrassegno chimico casuale del DNA o del RNA sulla lunghezza degli acidi nucleici è egualmente un metodo di contrassegno effettuato che permette ad un più alto grado di contrassegno una volta confrontato alle tecniche dicontrassegno.

Tuttavia, uno svantaggio di contrassegno casuale del prodotto chimico è modifica diretta delle basi del nucleotide, che diminuisce o impedisce l'accoppiamento delle basi fra i fili complementari mentre gli esperimenti di ibridazione sono in corso. Quindi, saldare il grado di contrassegno con il risparmio di temi di ibridazione della sonda in alcuni esperimenti specifici definitivamente è autorizzato.

Metodi enzimatici per il contrassegno dell'acido nucleico

La DNA polimerasi è un enzima usato per creare i polimeri del DNA tramite i trattamenti di estensione dell'allungamento o della mano di fondo del DNA.

Questi enzimi sono usati per generare le sonde dell'acido nucleico a caso incorporando i nucleotidi modificati durante il replicazione del dna, specialmente dalle procedure semplici di estensione della mano di fondo o dalle reazioni a catena della polimerasi. Tali sonde esibiscono l'alta specificità permettendo alla rilevazione anche delle quantità minuscole dell'obiettivo.

La transferasi terminale di deoxynucleotidyl (abbreviata solitamente come TdT) è un enzima della DNA polimerasi che è espresso in celle linfoidi sicure. Le sorgenti usuali dei modelli del DNA che possono essere modificati con TdT includono unico incagliato e delle mani di fondo adenoide di reazione a catena (PCR) della polimerasi come pure la restrizione a doppia elica dell'endonucleasi spezzetta con 3' sporgenze.

Un enzima conosciuto come la ligasi del RNA T4 (una ligasi Trifosfato di adenosina-dipendente) che proviene dal batteriofago T4 catalizza il legame fra un ′ del terminale 5 - fosfati e un ′ del terminale 3 - gruppo di idrossile sulla molecola del RNA.

Malgrado il substrato primario per questa ligasi specifica che è RNA, i termini della reazione possono essere ottimizzati per le molecole del DNA (più specificamente, molecole unico incagliate del DNA) pure, con rendimento piuttosto più basso.

La chinasi di polinucleotide T4 (abbreviata come T4 PNK), anche trovata in batteriofago T4, aiuta nel trasferimento un fosfato organico dalla molecola del trifosfato di adenosina nel ′ 5 - gruppo di idrossile di un acido nucleico. Questo enzima è indipendente del modello e può modificare efficientemente 5 sporgenze del ′ ed i polinucleotidi unico incagliati.

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Last Updated: Feb 26, 2019

Dr. Tomislav Meštrović

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Dr. Tomislav Meštrović

Dr. Tomislav Meštrović is a medical doctor (MD) with a Ph.D. in biomedical and health sciences, specialist in the field of clinical microbiology, and an Assistant Professor at Croatia's youngest university - University North. In addition to his interest in clinical, research and lecturing activities, his immense passion for medical writing and scientific communication goes back to his student days. He enjoys contributing back to the community. In his spare time, Tomislav is a movie buff and an avid traveler.

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