Par Jeyashree Sundaram, MBA
La chromatographie liquide de protéine rapide (FPLC) est une technique de chromatographie liquide pour la séparation des molécules de protéine sous pression. Elle diffère de la chromatographie liquide de haute performance parce que les pressions sont généralement inférieures, environ 435 à 580 LPC, de comparé à 3000 à 5000 LPC pour un système de CLHP.
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Dans cette méthode, la composition de la phase (liquide) mobile est variée à l'aide de différentes proportions de composantes dans les liquides qui composent l'éluant. Les conditions de la séparation sont mis à jour de telle manière que quand la composition de l'éluant change, il y a une adsorption différentielle à la phase stationnaire (de résine) des composantes de l'échantillon. Alors la composition de la phase mobile est alors changée de nouveau pour laisser la molécule d'intérêt désorber du fléau et réussir à l'extérieur avec l'éluant.
Principes et stratégies dans la purification de protéine
La protéine cible peut être un type ou recombiné existant naturellement. Elle peut ou ne peut être étiquetée. Ce peut être une protéine soluble ou ce peut être une protéine membrane-encastrée. Le but de la purification peut être pour des études structurelles ou fonctionnelles. Parfois, l'intention a pu être de l'employer pour le traitement ou comme réactif. Selon l'écaille, elle peut être analytique ou préparatoire. Et chacune de ces derniers, consécutivement, peut exiger le matériel différent. En dépit de ces diversités, il y a quelques thèmes courants dans le procédé de purification de protéine.
Quand la protéine d'intérêt est une protéine de fusion (étiquetée naturellement ou autrement), la spécificité de l'interaction entre les biomolécules (par exemple, entre l'antigène et l'anticorps, enzyme et son substrat) peut être tirée profit. De telles molécules sont épurées et concentrées par un procédé en pas à pas de chromatographie d'affinité, dans lequel la protéine est première sélecteur liée à la phase stationnaire et alors éluée à l'extérieur. Parfois, la tendance de la molécule de former un chélate spécifique en métal peut également être utilisée comme moyen réalisent le même but.
La purification réalisée par ce procédé peut être de l'ordre de 70-95%. Souvent, des niveaux plus élevés de la pureté sont exigés, dans ce cas un procédé multipas est utilisé. La prochaine opération serait d'employer la chromatographie d'échange ionique, un procédé où des interactions de charge entre les acides aminés dans la protéine (dites Glu, le sien, ou Arg) et des ligands pendant la phase stationnaire sont employés pour adsorber sélecteur la protéine d'intérêt et pour permettre aux contaminants de réussir.
Quand la protéine d'intérêt montre des interactions hydrophobes, une autre option telle que la chromatographie à phase renversée peut également être employée pour séparer la protéine des contaminants possibles. (« Polissant ") l'opération finale est souvent chromatographie d'exclusion de taille. Dans cette méthode, de plus petites molécules obtiennent enfermées dans les pores de la phase stationnaire tandis que la protéine plus grande d'intérêt traverse avec la phase mobile.
Paramètres d'optimisation dans la purification de protéine avec FPLC
Les défis les plus courants dans la purification de protéine avec FPLC tournent autour de mettre à jour la structure et la fonctionnalité de la protéine dans tout le procédé de purification. Les paramètres principaux qui influencent l'intégrité d'une protéine sont pH, le système de mise en mémoire tampon, et des sels.
Le pH et le système de mise en mémoire tampon sont relatifs. Les systemprovides de mise en mémoire tampon un pH qui est proche de celui dans lequel la protéine d'intérêt est normalement stable et soluble.
Le phosphate, les BALAIS, et les HEPES sont les tampons utilisés généralement dans la recommandation générale de FPLC.The est que le tampon devrait également avoir le PKa qui est à moins d'un élément de pH du pH désiré. La concentration d'un tampon influence également le pouvoir tampon. Environ 50-100 millimètres sont généralement suffisants. Il est également important que le tampon ne nuise pas l'activité de la protéine.
Des sels tels que NaCl (environ 150 millimètres) ou KCl (100-300 millimètres) sont compris dans les tampons pour imiter des conditions biologiques et pour maintenir la protéine soluble. Mais tout en déménageant d'une séparation chromatographique à l'autre dans le procédé de purification, la concentration en sel peut varier, par exemple, le bas maintenu (environ 25 millimètres de NaCl) avec la chromatographie d'ion, mais grimpé jusqu'à plus que le triple (environ 500 millimètres) avec la chromatographie d'exclusion d'affinité ou de taille.
Les agents réducteurs (DTT, TCEP, mercaptoéthanol 2) sont parfois ajoutés aux tampons pour éviter l'oxydation et la totalisation de protéine. D'autres additifs employés pour augmenter la stabilité de protéine comprennent des inhibiteurs de la protéase (PMSF, pepstatin A), osmolytes (Triton X-100, NP-40), et chélateurs en métal (EDTA, EGTA). Mais tout ceux-ci devraient être choisis avec soin. Ils devraient être employés seulement quand ils sont avantageux pour la séparation actuelle.
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