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Depurazione d'ottimizzazione della proteina con FPLC

Da Jeyashree Sundaram, MBA

La cromatografia a fase mobile liquida della proteina veloce (FPLC) è una tecnica di cromatografia a fase mobile liquida per la separazione di molecole di proteina sotto pressione. Differisce da cromatografia liquida a alta pressione in quanto le pressioni sono generalmente più basse, intorno 435 - 580 PSI, confrontati a 3000 - 5000 PSI per un sistema di HPLC.

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In questo metodo, la composizione della fase (liquida) mobile è variata utilizzando le proporzioni differenti di componenti nei liquidi che compongono l'eluente. Gli stati della separazione sono mantenuti in tal modo che quando la composizione dell'eluente cambia, c'è un adsorbimento differenziale alla fase stazionaria (della resina) delle componenti del campione. Poi la composizione della fase mobile poi è cambiata ancora per lasciare la molecola di interesse dissorbire dalla colonna e passare fuori con l'eluente.

Principi e strategie nella depurazione della proteina

La proteina bersaglio può essere un recombinante tipo o che esiste naturalmente. Può o non può essere etichettata. Può essere una proteina solubile o può essere una proteina membrana-incassata. Lo scopo di depurazione può essere per gli studi strutturali o funzionali. A volte, l'intenzione ha potuto essere di usarlo per la terapia o come reagente. Secondo il disgaggio, può essere analitica o preparatoria. E ciascuno di questi, a sua volta, può richiedere la strumentazione differente. Malgrado queste diversità, ci sono alcuni temi comuni all'interno del trattamento di depurazione della proteina.

Quando la proteina di interesse è una proteina di fusione (etichettata naturalmente o altrimenti), la specificità di interazione fra le biomolecole (per esempio, fra l'antigene e l'anticorpo, enzima ed il suo substrato) può essere approfittata di. Tali molecole sono depurate e concentrate con un trattamento a passo singolo della cromatografia di affinità, in cui la proteina è prima limitata selettivamente alla fase stazionaria ed allora eluita fuori. A volte, la tendenza della molecola a formare un chelato specifico del metallo può anche essere usata raggiunge lo stesso scopo.

La depurazione raggiunta tramite questo trattamento può essere nell'ordine di 70-95%. Spesso, i livelli elevati della purezza sono richiesti, nel qual caso un trattamento a più gradi è impiegato. Il punto seguente sarebbe di usare la cromatografia di scambio ionico, un trattamento dove interazioni della tassa fra gli amminoacidi nella proteina (dica Glu, suo, o Arg) ed i leganti nella fase stazionaria sono usati per adsorbire selettivamente la proteina di interesse e per permettere che gli agenti inquinanti passino da parte a parte.

Quando la proteina di interesse mostra le interazioni idrofobe, un'altra opzione quale la cromatografia in controfase può anche essere usata per separare la proteina dagli agenti inquinanti possibili. (“Lucidando ") il punto definitivo è spesso la cromatografia di esclusione di dimensione. In questo metodo, le più piccole molecole ottengono intrappolate all'interno dei pori della fase stazionaria mentre la più grande proteina di interesse attraversa con la fase mobile.

Parametri di ottimizzazione nella depurazione della proteina con FPLC

Le sfide più comuni nella depurazione della proteina con FPLC girano intorno a mantenere la struttura e la funzionalità della proteina in tutto il trattamento di depurazione. I parametri principali che influenzano l'integrità di una proteina sono pH, il sistema di bufferizzazione e sali.

Il pH ed il sistema di bufferizzazione sono relativi. Gli systemprovides di bufferizzazione un pH che è vicino a quello in cui la proteina di interesse è normalmente stabile e solubile.

Il fosfato, le ZAZZERE e HEPES sono buffer comunemente usati nella raccomandazione generale di FPLC.The è che il buffer dovrebbe anche avere il PKa che è all'interno di un'unità di pH del pH desiderato. La concentrazione di buffer egualmente influenza il potere tampone. Circa 50-100 millimetri sono generalmente sufficienti. È ugualmente importante che il buffer non interferisce con l'attività della proteina.

I sali quali NaCl (circa 150 millimetri) o KCl (100-300 millimetri) sono inclusi nei buffer per imitare le circostanze biologiche e per tenere la proteina solubile. Ma mentre si muove dall'una separazione cromatografica verso un altro nel trattamento di depurazione, la concentrazione nel sale può variare, per esempio, minimo tenuto (circa 25 millimetri di NaCl) con cromatografia dello ione, ma aumentato a più del triplo (circa 500 millimetri) con cromatografia di esclusione di dimensione o di affinità.

Gli agenti riduttori (DTT, TCEP, mercaptoetanolo 2) a volte si aggiungono ai buffer per impedire l'ossidazione e l'aggregazione della proteina. Altri additivi usati per aumentare la stabilità della proteina includono gli inibitori di proteasi (PMSF, pepstatin A), i osmolytes (Tritone X-100, NP-40) ed i chelatori del metallo (ED, EGTA). Ma tutto questi dovrebbero essere scelti con attenzione. Dovrebbero essere usati soltanto quando sono utili per la separazione attuale.

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Last Updated: May 24, 2019

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