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Purificação de aperfeiçoamento da proteína com FPLC

Por Jeyashree Sundaram, MBA

A cromatografia líquida da proteína rápida (FPLC) é uma técnica da cromatografia líquida para a separação de moléculas de proteína sob a pressão. Difere da cromatografia líquida do elevado desempenho que as pressões são geralmente mais baixas, ao redor 435 a 580 libras por polegada quadrada, comparadas a 3000 a 5000 libras por polegada quadrada para um sistema da HPLC.

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Neste método, a composição da fase (líquida) móvel é variada usando proporções diferentes de componentes nos líquidos que compo o eluente. As condições da separação estão mantidas de tal maneira que quando a composição do eluente muda, há uma adsorção diferencial à fase estacionária (da resina) dos componentes da amostra. A composição da fase móvel é mudada então então outra vez para deixar a molécula do interesse desorb da coluna e passar para fora com o eluente.

Princípios e estratégias na purificação da proteína

A proteína do alvo pode ser um tipo ou de recombinação que existem naturalmente. Pode ou não pode ser etiquetada. Pode ser uma proteína solúvel ou pode ser uma proteína membrana-encaixada. A finalidade da purificação pode ser para estudos estruturais ou funcionais. Às vezes, a intenção podia ser usá-la para a terapia ou como um reagente. Segundo a escala, pode ser analítica ou preparatória. E cada um destes, por sua vez, pode exigir o equipamento diferente. Apesar destas diversidades, há alguns temas comuns dentro do processo da purificação da proteína.

Quando a proteína do interesse é uma proteína da fusão (etiquetada naturalmente ou de outra maneira), a especificidade da interacção entre biomoléculas (por exemplo, entre o antígeno e o anticorpo, enzima e sua carcaça) pode ser aproveitada. Tais moléculas são refinadas e concentradas com um processo de uma etapa da cromatografia de afinidade, em que a proteína é primeira limitada selectivamente à fase estacionária e eluted então para fora. Às vezes, a tendência da molécula formar um quelato específico do metal pode igualmente ser usada consegue a mesma finalidade.

A purificação conseguida por este processo pode estar na escala de 70-95%. Frequentemente, uns níveis mais altos de pureza estão exigidos, neste caso um processo multistep é empregado. O passo seguinte seria usar a cromatografia da troca iónica, um processo onde interacções da carga entre ácidos aminados na proteína (diga Glu, seu, ou Arg) e as ligantes na fase estacionária são usadas para fixar selectivamente a proteína do interesse e para permitir que os contaminadores passem completamente.

Quando a proteína do interesse mostra interacções hidrofóbicas, uma outra opção tal como a cromatografia da inverter-fase pode igualmente ser usada para separar a proteína dos contaminadores possíveis. (“Lustrando ") a etapa final é frequentemente cromatografia da exclusão do tamanho. Neste método, as moléculas menores obtêm prendidas dentro dos poros da fase estacionária quando a proteína maior do interesse passar completamente com a fase móvel.

Parâmetros da optimização na purificação da proteína com FPLC

Os desafios os mais comuns na purificação da proteína com FPLC revolvem em torno de manter a estrutura e a funcionalidade da proteína durante todo o processo da purificação. Os parâmetros principais que influenciam a integridade de uma proteína são pH, o sistema da protecção, e sais.

O pH e o sistema da protecção são relacionados. Os systemprovides da protecção um o pH que é próximo a esse em que a proteína do interesse é normalmente estável e solúvel.

O fosfato, os ESPANADORES, e HEPES são amortecedores de uso geral na recomendação geral de FPLC.The são que o amortecedor deve igualmente ter um PKa que esteja dentro de uma unidade do pH do pH desejado. A concentração de um amortecedor igualmente influencia a capacidade de protecção. Aproximadamente 50-100 milímetros são geralmente suficientes. É igualmente importante que o amortecedor não interfere com a actividade da proteína.

Os sais tais como NaCl (aproximadamente 150 milímetros) ou KCl (100-300 milímetros) são incluídos nos amortecedores para imitar circunstâncias biológicas e para manter a proteína solúvel. Mas ao se mover de uma separação cromatográfica para outra no processo da purificação, a concentração de sal pode variar, por exemplo, ponto baixo mantido (aproximadamente 25 milímetros de NaCl) com cromatografia do íon, mas aumentado a mais do que triplicar-se (aproximadamente 500 milímetros) com cromatografia da exclusão da afinidade ou do tamanho.

Os agentes de diminuição (DTT, TCEP, mercaptoethanol 2) são adicionados às vezes aos amortecedores para impedir a oxidação e a agregação da proteína. Outros aditivos usados para aumentar a estabilidade da proteína incluem inibidores de protease (PMSF, pepstatin A), osmolytes (Triton X-100, NP-40), e chelators do metal (o EDTA, EGTA). Mas todo o estes devem ser escolhidos com cuidado. Devem ser usados somente quando são benéficos para a separação à mão.

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Last Updated: May 24, 2019

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