Advertencia: Esta página es una traducción de esta página originalmente en inglés. Tenga en cuenta ya que las traducciones son generadas por máquinas, no que todos traducción será perfecto. Este sitio Web y sus páginas están destinadas a leerse en inglés. Cualquier traducción de este sitio Web y su páginas Web puede ser imprecisa e inexacta en su totalidad o en parte. Esta traducción se proporciona como una conveniencia.

Purificación óptima de la proteína con FPLC

Por Jeyashree Sundaram, MBA

La cromatografía líquida de la proteína rápida (FPLC) es una técnica de la cromatografía líquida para la separación de moléculas de proteína bajo presión. Difiere de la cromatografía líquida del alto rendimiento en que las presiones son generalmente más inferiores, alrededor 435 a 580 PSI, comparadas a 3000 a 5000 PSI para un sistema de la CLAR.

Haber: 7mo Estudio Shutterstock.com del hijo

En este método, la composición de la fase (líquida) movible se varía usando diversas proporciones de componentes en los líquidos que componen el eluyente. Las condiciones de la separación se mantienen de una manera tal que cuando la composición del eluyente cambia, hay una adsorción diferenciada a la fase estacionaria (de la resina) de los componentes de la muestra. Entonces la composición de la fase movible entonces se cambia otra vez para permitir la molécula del interés deabsorber de la olumna y pasar fuera con el eluyente.

Principios y estrategias en la purificación de la proteína

La proteína del objetivo puede ser un tipo o recombinante que existe naturalmente. Puede o no puede ser marcada con etiqueta. Puede ser una proteína soluble o puede ser una proteína membrana-embutida. El propósito de la purificación puede estar para los estudios estructurales o funcionales. A veces, el intento podía ser utilizarlo para la terapia o como reactivo. Dependiendo de la escala, puede ser analítico o preparatorio. Y cada uno de éstos, a su vez, puede requerir diverso equipo. A pesar de estas diversidades, hay algunos temas comunes dentro del proceso de la purificación de la proteína.

Cuando la proteína del interés es una proteína de la fusión (marcada con etiqueta naturalmente o de otra manera), la especificidad de la acción recíproca entre las biomoléculas (e.g., entre el antígeno y el anticuerpo, enzima y su substrato) puede ser aprovechada. Tales moléculas se purifican y se concentran con un proceso de un solo paso de la cromatografía de afinidad, en el cual la proteína es primera limitada selectivamente a la fase estacionaria y después enjuagada fuera. A veces, la tendencia de la molécula de formar un quelato específico del metal se puede también utilizar logra el mismo propósito.

La purificación lograda por este proceso puede estar en el rango de 70-95%. A menudo, niveles más altos de pureza se requieren, en este caso se emplea un proceso de varias fases. El paso siguiente sería utilizar la cromatografía de intercambio iónico, un proceso donde las acciones recíprocas de la carga entre los aminoácidos en la proteína (diga Glu, el suyo, o Arg) y los ligands en la fase estacionaria se utilizan para adsorber selectivamente la proteína del interés y para permitir que los contaminantes pasen a través.

Cuando la proteína del interés muestra acciones recíprocas hidrofóbicas, otra opción tal como cromatografía inversa se puede también utilizar para separar la proteína de los contaminantes posibles. (“Puliendo ") el paso final es a menudo cromatografía de la exclusión de la talla. En este método, moléculas más pequeñas consiguen atrapadas dentro de los poros de la fase estacionaria mientras que la proteína más grande del interés pasa a través con la fase movible.

Parámetros de la optimización en la purificación de la proteína con FPLC

Los retos mas comunes de la purificación de la proteína con FPLC giran alrededor de mantener la estructura y las funciones de la proteína en el proceso de la purificación. Los parámetros principales que influencian la integridad de una proteína son pH, el sistema del buffering, y sales.

El pH y el sistema del buffering son relacionados. Los systemprovides del buffering un pH que está cercano al en el cual la proteína del interés es normalmente estable y soluble.

El fosfato, las FREGONAS, y HEPES son almacenadores intermedios de uso general en la recomendación general de FPLC.The es que el almacenador intermedio debe también tener PKa que esté dentro de una unidad del pH del pH deseado. La concentración de un almacenador intermedio también influencia capacidad tapón. Cerca de 50-100 milímetros son generalmente suficientes. Es igualmente importante que el almacenador intermedio no interfiere con la actividad de la proteína.

Las sales tales como NaCl (cerca de 150 milímetros) o KCl (100-300 milímetros) se incluyen en los almacenadores intermedios para imitar condiciones biológicas y para mantener la proteína soluble. Pero mientras que se mueve a partir de una separación cromatográfica a otra en el proceso de la purificación, la concentración de la sal puede variar, por ejemplo, ciclón guardado (cerca de 25 milímetros de NaCl) con cromatografía del ión, pero aumentado más que el triple (cerca de 500 milímetros) con cromatografía de la exclusión de la afinidad o de la talla.

Los reductores (DTT, TCEP, mercaptoetanol 2) se agregan a veces a los almacenadores intermedios para prevenir la oxidación y la agregación de la proteína. Otros añadidos usados para aumentar estabilidad de la proteína incluyen los inhibidores de proteasa (PMSF, pepstatin A), osmolytes (Tritón X-100, NP-40), y queladores del metal (EDTA, EGTA). Pero todo el éstos se deben elegir con cuidado. Deben ser utilizados solamente cuando son beneficiosos para la separación a mano.

Fuentes:

Further Reading

Last Updated: May 24, 2019

Comments

The opinions expressed here are the views of the writer and do not necessarily reflect the views and opinions of News Medical.