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Cristallizzazione della proteina

La cristallizzazione della proteina è uno strumento importante per depurare le proteine come pure per dimostrare la loro purezza chimica.

Questo trattamento è essenziale per cristallografia a raggi x, un campo che ha contribuito enorme alla nostra comprensione della struttura atomica e molecolare anche al livello dell'acido nucleico e della proteina. Questi cristalli contribuiscono a delineare la struttura tridimensionale delle macromolecole complesse e delle loro funzioni come pure come funzionano nel mondo reale.

Principio

La cristallizzazione delle proteine è basata sulla combinazione attenta della soluzione soprasatura del composto con i reagenti di cristallizzazione o di precipitazione negli stati del laboratorio di destra per indurre la nucleazione e la crescita di un cristallo della proteina.

Procedura

I seguenti punti sono seguiti per cristallizzare una proteina:

Caratterizzazione delle proteine

Almeno alcuni milligrammi della necessità della proteina di essere depurato e poi di essere caratterizzato dalla spettroscopia circolare (CD) di dicroismo per studiare la struttura ed attività della proteina, fluorometria di scansione differenziale, scattering leggero dinamico che assicura la multidispersione bassa, o ultracentrifugazione. La stabilità della proteina in presenza di vari additivi e leganti deve anche essere studiata. Questo punto è essenziale per il successo della cristallografia.

Cristallizzazione della proteina

Questo trattamento dipende dalle leggi fisiche e chimiche ed è il risultato di precipitazione della soluzione soprasatura della proteina. L'incapacità di usare le temperature elevate per raggiungere la soprasaturazione delle proteine è sormontata utilizzando altri fattori quali i tipi differenti di sali nella soluzione tampone, o usando i cofattori per aumentare la solubilità della proteina. I precipitanti d'uso comune includono il solfato dell'ammonio ed il polietilene glicole. Le soluzioni commerciali della selezione del premade sono usate per scoprire il genere di circostanze che favorisce la cristallizzazione della proteina. Queste circostanze poi sono ottimizzate per permettere alla crescita di grandi cristalli puri che possono essere sottoposti a cristallografia a raggi x.

I metodi più comunemente usati per cristallizzazione della proteina comprendono la goccia d'attaccatura e la goccia di seduta, entrambe usate con i metodi della diffusione del vapore.

International Space Station Protein Crystal Growth

Difficoltà con cristallizzazione della proteina

Il campione deve essere preparato e depurato con attenzione ed essere solubilizzato nel giusto ambiente del buffer per produrre i cristalli. La massimi purezza e monodispersity possibili è lo scopo del preparato del campione.

La stabilità è un'altra preoccupazione primaria. Lo stoccaggio deve appropriarsi di tutto il deterioramento in termini di cambiamento o denaturazione conformazionale, dell'oligomerizzazione o di qualsiasi cambiamento prima o nella fase di formazione di cristallo.

La soprasaturazione poi è raggiunta facendo uso di giusta combinazione di reagenti, pH del buffer, la giusta temperatura ed eccipienti o gli additivi. Le molecole di proteina sono incoraggiate a associarsi in un modo ordinato senza precipitazione o la separazione di fase, o l'aggregazione disordinata. Una volta che la nucleazione è indotta giustamente, con i numeri, la dimensione e la qualità adeguati, l'ambiente deve essere teso per limitare ulteriore nucleazione e per promuovere la crescita dei cristalli controllata. Uno sviluppato, i cristalli deve essere protetto contro danno fisico o chimico.

Il controllo del sistema è essenziale per tenerlo puro, completamente specificato ed identicamente, dall'inizio alla fine. Ciò impedisce l'introduzione delle impurità nel cristallo crescente ed assicura che gli stati del laboratorio siano riproducibili.

Purtroppo, questo trattamento dipende da un'intera miriade di fattori biochimici, fisici e chimici. Ciò rende alla normalizzazione di cristallizzazione della proteina un compito dell'irritazione, con la necessità di comprensione della miscela giusta dei prodotti chimici, il comportamento della proteina in varie fasi e la nucleazione come pure la crescita dei cristalli. I sistemi robot da occuparsi automaticamente e precisamente di questi trattamenti, nelle quantità del nanoliter, sono stati messi a punto per i più grandi laboratori, ma sono spesso troppo costosi per le più piccole impostazioni.

La cristallizzazione della proteina rimane così un'arte e una scienza che è ancora in costruzione. La crescita di un cristallo di cui l'unità è una macromolecola ha composto di migliaia e migliaia di atomi nelle disposizioni complesse in strutture primarie, secondarie e terziarie, con i vari gradi di libertà possibili ad ogni atomo, è necessariamente un compito che ancora è guidato da conoscenza empirica finora piuttosto di quanto la teoria stabilita.

Riferimenti

  1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3943105/
  2. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1764865/
  3. http://www.proteinstructures.com/Experimental/Experimental/crystallization-tools.html
  4. https://hamptonresearch.com/documents/growth_101/35.pdf
  5. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3182643/
  6. http://www.xray.bioc.cam.ac.uk/xray_resources/whitepapers/xtal-in-action/node3.html

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Last Updated: Feb 26, 2019

Dr. Liji Thomas

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Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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