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Cristalização da proteína

A cristalização da proteína é uma ferramenta importante para refinar proteínas assim como para demonstrar sua pureza química.

Este processo é essencial para o cristalografia do raio X, um campo que contribua enorme a nossa compreensão da estrutura atômica e molecular mesmo a nível da proteína e do ácido nucleico. Estes cristais ajudam a traçar a estrutura tridimensional de macromoléculas complexas e de suas funções, assim como como se operam no mundo real.

Princípio

A cristalização das proteínas é baseada na combinação cuidadosa da solução supersaturated do composto com os reagentes da precipitação ou da cristalização sob as condições do laboratório do direito para induzir a nucleação e o crescimento de um cristal da proteína.

Procedimento

As seguintes etapas são seguidas para cristalizar uma proteína:

Caracterização da proteína

Pelo menos alguns miligramas da necessidade da proteína de ser refinado e caracterizado então pela espectroscopia circular (CD) do dicroísmo para estudar a estrutura e a actividade da proteína, o fluorometry da exploração diferencial, dispersão de luz dinâmica que assegura a baixa polidispersidade, ou ultracentrifugation. A estabilidade da proteína na presença dos vários aditivos e ligantes deve igualmente ser estudada. Esta etapa é essencial para o sucesso do cristalografia.

Cristalização da proteína

Este processo é dependente das leis físicas e químicas, e é o resultado de precipitar uma solução supersaturated da proteína. A incapacidade usar altas temperaturas para conseguir o supersaturation das proteínas é superada usando outros factores tais como tipos diferentes de sal na solução de amortecedor, ou usando cofactor para aumentar a solubilidade da proteína. Os Precipitants incluem de uso comum o sulfato do amónio e o glicol de polietileno. As soluções comerciais da selecção do premade são usadas para encontrar o tipo das circunstâncias que favorece a cristalização da proteína. Estas circunstâncias são aperfeiçoadas então para permitir o crescimento dos grandes cristais puros que podem ser sujeitados ao cristalografia do raio X.

Os métodos os mais de uso geral para a cristalização da proteína incluem a gota de suspensão e a gota de assento, ambos usados com métodos da difusão do vapor.

International Space Station Protein Crystal Growth

Dificuldades com cristalização da proteína

A amostra precisa de ser preparada e refinado com cuidado e solubilized no ambiente direito do amortecedor para produzir cristais. A pureza e o monodispersity máximos possíveis são o alvo da preparação da amostra.

A estabilidade é uma outra preocupação principal. O armazenamento deve cancelar toda a deterioração em termos da mudança ou da desnaturação conformational, oligomerization ou uma mudança antes ou durante o processo da formação de cristal.

O Supersaturation é conseguido então usando a combinação direita de reagentes, pH do amortecedor, a temperatura direita, e excipientes ou aditivos. As moléculas de proteína são incentivadas associar em uma maneira em ordem sem a precipitação ou a separação de fase, ou agregação desordenada. Uma vez que a nucleação é induzida apropriadamente, com números, tamanho e qualidade adequados, o ambiente deve ser tendido a restringir uma nucleação mais adicional e a promover crescimento de cristal controlado. Um crescido, os cristais precisa de ser protegido contra dano físico ou químico.

O controle do sistema é essencial mantê-lo puro, especificado inteiramente, e inalterado, do começo ao fim. Isto impede a introdução de impurezas no cristal crescente e assegura-se de que as condições do laboratório sejam reprodutíveis.

Infelizmente, este processo depende em cima de um anfitrião inteiro de factores bioquímicos, físicos, e químicos. Isto faz a normalização da cristalização da proteína uma tarefa aborrecendo, com a necessidade de compreender a mistura direita de produtos químicos, o comportamento da proteína em várias fases, e a nucleação assim como o crescimento dos cristais. Os sistemas robóticos a tratar automaticamente e precisamente estes processos, em quantidades do nanoliter, foram desenvolvidos para laboratórios maiores, mas são frequentemente demasiado caros para instalações menores.

A cristalização da proteína permanece assim uma arte e uma ciência que esteja ainda sob a construção. O crescimento de um cristal cuja a unidade fosse uma macromolécula comps dos milhares em cima dos milhares de átomos no regime complexo em estruturas preliminares, secundárias e terciárias, com os vários graus de liberdade possíveis a cada átomo, é necessariamente uma tarefa que fosse guiada ainda pelo conhecimento empírico até agora um pouco do que a teoria estabelecida.

Referências

  1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3943105/
  2. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1764865/
  3. http://www.proteinstructures.com/Experimental/Experimental/crystallization-tools.html
  4. https://hamptonresearch.com/documents/growth_101/35.pdf
  5. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3182643/
  6. http://www.xray.bioc.cam.ac.uk/xray_resources/whitepapers/xtal-in-action/node3.html

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Last Updated: Feb 26, 2019

Dr. Liji Thomas

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Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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