Cromatografia di Pseudo-Affinità

La cromatografia è la separazione di composti da una miscela e questa dipende dai beni del composto. Questi beni comprendono la dimensione e la tassa dei composti ed anche come interagiscono con le fasi mobili e solide.

Fiale del campione di caricamento del tecnico in scaffale della campionatrice automatica. Credito di immagine: Stokkete/Shutterstock
Fiale del campione di caricamento del tecnico in scaffale della campionatrice automatica. Credito di immagine: Stokkete/Shutterstock

Cromatografia di Pseudo-Affinità e di affinità

La cromatografia di affinità è dove un legante specifico si aggiunge alla fase solida, che cattura il composto di interesse come una proteina specifica. La natura specifica di questa interazione significa che la proteina di interesse può essere separata da una miscela delle proteine. La proteina di interesse può poi successivamente essere rilasciata dal legante cambiando i termini della cromatografia.

Di simile modo, la cromatografia di pseudo-affinità utilizza le tinture come proteine bersaglio dei leganti per. Le tinture hanno usato il mimo i leganti, ma non non video l'alta specificità. Di conseguenza, queste tinture possono catturare varie proteine.

Come la cromatografia di Pseudo-Affinità funziona? - Un esempio

Uno studio da Tulsani e dal co. ha esaminato usando la cromatografia di pseudo-affinità per separare tre enzimi dai muscoli del coniglio: deidrogenasi, piruvato chinasi ed aldolasi del lattato.

Qui, il guar unito con legami atomici incrociati e la pectina unita con legami atomici incrociati sono stati usati per vincolare le varie tinture della triazine. Per vincolare la tintura, in primo luogo il guar unito con legami atomici incrociati e la pectina unita con legami atomici incrociati sono stati lavati in acqua deionizzata e poi sono stati sospesi in acqua deionizzata fresca. La tintura poi si è aggiunta al gel e questa è stata mescolata per circa 5 min. che il sale si è aggiunto a questa miscela e poi la miscela è stata mescolata per i 30 min. più ancora l'idrossido di sodio poi si è aggiunto alla miscela e questo è stato mescolato per 16 - 18 ore. Per concludere, questa miscela è stata lavata in acqua deionizzata.

Il gel, ora con il limite della tintura, è stato collocato nelle colonne 2ml. Una volta che il tampone fosfato avesse attraversato la colonna, il campione della proteina grezza è stato caricato sulla cima della colonna. Una volta che il campione avesse attraversato, la colonna è stata lavata con il buffer per eliminare le proteine che erano non legate. Ciò è stata verificata misurando la capacità di assorbimento del buffer che lascia la colonna a 280nm facendo uso di uno spettrofotometro. Una volta che pulita, la proteina rilegata è stata rilasciata usando lo stesso buffer, ma con sale aggiunto, NAD+ o il piruvato del sodio.

Il trattamento è riuscito a separare la deidrogenasi, il piruvato chinasi e l'aldolasi del lattato. È stato trovato che le tinture 1014 e deidrogenasi del lattato conservata 1015 ed il limite 1015 a pectina unita con legami atomici incrociati egualmente hanno conservato il piruvato chinasi. Tuttavia, l'aldolasi non è stata conservata da c'è ne delle 10 tinture provate in questo studio.

Eliminando le proteine dal plasma

Ci sono proteine presenti in plasma umano, che è la componente liquida di sangue. Ciò è una miscela altamente complessa, di cui 75% sono albumina ed immunoglobulina umane G (IgG), un tipo di anticorpo. Ciò significa che quelle proteine sono individuate molto facilmente, ma anche che potrebbero impedire altre proteine essere individuata. Ciò potrebbe essere problematica, poichè gli indicatori diagnostici per determinate malattie potrebbero essere quelle proteine dell'basso abbondanza. Di conseguenza, la rimozione di albumina e di IgG è un punto cruciale nel preparare il siero per gli scopi diagnostici.

Uno studio da Urbas e dal co. ha esaminato l'ottimizzazione dei metodi impiegati per eliminare l'albumina e IgG da plasma. Qui, non solo hanno usato la cromatografia di pseudo-affinità per eliminare selettivamente l'albumina, ma hanno combinato questo con la cromatografia di affinità in modo che sia l'albumina che IgG potessero essere eliminati allo stesso tempo. Mentre questo è risultato efficiente, la tintura mimetica blu il SA A6XL utilizzata nella cromatografia di pseudo-affinità per eliminare l'albumina non era altamente specifica. Di conseguenza, la capacità di questo sistema di eliminare l'albumina dipendeva dalla quantità di plasma caricata sulla colonna. Se più plasma fosse caricato sulla colonna, la quantità aumentata di albumina poteva spostare le altre proteine dalla tintura.

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Last Updated: Oct 29, 2018

Dr. Maho Yokoyama

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Dr. Maho Yokoyama

Dr. Maho Yokoyama is a researcher and science writer. She was awarded her Ph.D. from the University of Bath, UK, following a thesis in the field of Microbiology, where she applied functional genomics to Staphylococcus aureus . During her doctoral studies, Maho collaborated with other academics on several papers and even published some of her own work in peer-reviewed scientific journals. She also presented her work at academic conferences around the world.

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