Cromatografia da Pseudo--Afinidade

A cromatografia é a separação de compostos de uma mistura, e esta é dependente das propriedades do composto. Estas propriedades incluem o tamanho e a carga dos compostos, e também como interagem com as fases móveis e contínuas.

Tubos de ensaio da amostra da carga do técnico na cremalheira do mostruário automático. Crédito de imagem: Stokkete/Shutterstock
Tubos de ensaio da amostra da carga do técnico na cremalheira do mostruário automático. Crédito de imagem: Stokkete/Shutterstock

Cromatografia da afinidade e da Pseudo--Afinidade

A cromatografia de afinidade é o lugar onde uma ligante específica é adicionada à fase contínua, que captura o composto do interesse como uma proteína específica. A natureza específica desta interacção significa que a proteína do interesse pode ser separada de uma mistura das proteínas. A proteína do interesse pode então subseqüentemente ser liberada da ligante mudando as condições da cromatografia.

Na forma similar, a cromatografia da pseudo--afinidade utiliza tinturas como ligantes a fim visar proteínas. As tinturas usaram a indicação as ligantes, mas não indicam a especificidade alta. Conseqüentemente, estas tinturas podem capturar uma variedade de proteínas.

Como a cromatografia da Pseudo--Afinidade trabalha? - Um exemplo

Um estudo por Tulsani e por co. olhou de utilização a cromatografia da pseudo--afinidade para separar três enzimas dos músculos do coelho: desidrogenase do lactato, quinase do piruvato e aldolase.

Aqui, o guar ligado e a pectina ligada foram usados para imobilizar várias tinturas do triazine. Para imobilizar a tintura, primeiramente o guar ligado e a pectina ligada foram lavados na água deionized, e suspendidos então na água deionized fresca. A tintura foi adicionada então ao gel, e esta foi agitada por aproximadamente 5 minutos. O sal foi adicionado a esta mistura, e a mistura foi agitada então para uns 30 minutos mais adicionais. O hidróxido de sódio foi adicionado então à mistura, e este foi agitado por 16 - 18 horas. Finalmente, esta mistura foi lavada na água deionized.

O gel, agora com o limite da tintura, foi colocado nas colunas 2ml. Uma vez que o amortecedor de fosfato tinha passado através da coluna, a amostra da proteína bruta foi carregada na parte superior da coluna. Uma vez que a amostra tinha passado completamente, a coluna foi lavada com o amortecedor para remover as proteínas que foram desatadas. Isto foi verificado medindo a absorvência do amortecedor que sae da coluna em 280nm usando um espectrofotômetro. Uma vez que limpa, a proteína encadernada foi liberada usando o mesmo amortecedor, mas com sal adicionado, NAD+ ou piruvato do sódio.

O processo controlou separar a desidrogenase do lactato, a quinase do piruvato e o aldolase. Encontrou-se que as tinturas 1014 e desidrogenase retida 1015 do lactato, e o limite 1015 à pectina ligada igualmente retiveram a quinase do piruvato. Contudo, o aldolase não foi retido por algumas das 10 tinturas testadas neste estudo.

Removendo as proteínas do plasma

Há proteínas actuais no plasma humano, que é o componente líquido do sangue. Esta é uma mistura altamente complexa, de que 75% são a albumina de soro e a imunoglobulina humanas G (IgG), um tipo de anticorpo. Isto significa que aquelas proteínas estão detectadas muito facilmente, mas também que poderiam impedir que outras proteínas estejam detectadas. Isto poderia ser problemático, porque as doenças diagnósticas dos marcadores com certeza poderiam ser aquelas proteínas da baixo-abundância. Conseqüentemente, a remoção da albumina de soro e do IgG é uma etapa crucial em preparar o soro para finalidades diagnósticas.

Um estudo por Urbas e por co. olhou o aperfeiçoamento dos métodos usados para remover a albumina de soro e o IgG do plasma. Aqui, eles não somente cromatografia usada da pseudo--afinidade para remover selectivamente a albumina de soro, mas combinado isto com a cromatografia de afinidade de modo que a albumina de soro e IgG pudessem ser removidos ao mesmo tempo. Quando isto foi encontrado para ser eficiente, a tintura Mimetic azul SA A6XL usada na cromatografia da pseudo--afinidade para remover a albumina de soro não era altamente específica. Conseqüentemente, a capacidade deste sistema para remover a albumina de soro dependeu da quantidade de plasma carregada na coluna. Se mais plasma foi carregado na coluna, a quantidade aumentada de albumina de soro podia deslocar as outras proteínas da tintura.

Fontes

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Last Updated: Oct 29, 2018

Dr. Maho Yokoyama

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Dr. Maho Yokoyama

Dr. Maho Yokoyama is a researcher and science writer. She was awarded her Ph.D. from the University of Bath, UK, following a thesis in the field of Microbiology, where she applied functional genomics to Staphylococcus aureus . During her doctoral studies, Maho collaborated with other academics on several papers and even published some of her own work in peer-reviewed scientific journals. She also presented her work at academic conferences around the world.

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