Cromatografía de la Pseudo-Afinidad

La cromatografía es la separación de composiciones de una mezcla, y ésta es relacionada en las propiedades de la composición. Estas propiedades incluyen la talla y la carga de las composiciones, y también cómo obran recíprocamente con las fases movibles y sólidas.

Frascos de la muestra del cargamento del técnico en cremallera del muestreador automático. Haber de imagen: Stokkete/Shutterstock
Frascos de la muestra del cargamento del técnico en cremallera del muestreador automático. Haber de imagen: Stokkete/Shutterstock

Cromatografía de la afinidad y de la Pseudo-Afinidad

La cromatografía de afinidad es donde un ligand específico se agrega a la fase sólida, que captura la composición del interés como una proteína específica. La naturaleza específica de esta acción recíproca significa que la proteína del interés se puede separar de una mezcla de proteínas. La proteína del interés se puede entonces liberar posteriormente del ligand cambiando las condiciones de la cromatografía.

En la moda similar, la cromatografía de la pseudo-afinidad utiliza los tintes como los ligands para apuntar las proteínas. Los tintes utilizaron al imitador los ligands, pero no visualizan alta especificidad. Por lo tanto, estos tintes pueden capturar una variedad de proteínas.

¿Cómo la cromatografía de la Pseudo-Afinidad trabaja? - Un ejemplo

Un estudio por Tulsani y el co. observaba con la cromatografía de la pseudo-afinidad para separar tres enzimas de los músculos del conejo: deshidrogenasa del lactato, cinasa del piruvato y aldolasa.

Aquí, el guar reticulado y la pectina reticulada fueron utilizados para inmovilizar los diversos tintes de la triazina. Para inmovilizar el tinte, primero el guar reticulado y la pectina reticulada fueron lavados en agua desionizada, y después suspendidos en agua desionizada fresca. El tinte entonces fue agregado al gel, y esto fue revuelta por cerca de 5 minutos. La sal fue agregada a esta mezcla, y entonces la mezcla fue revuelta para 30 minutos más. El hidróxido de sodio entonces fue agregado a la mezcla, y esto fue revuelta por 16 - 18 horas. Finalmente, esta mezcla fue lavada en agua desionizada.

El gel, ahora con el salto del tinte, fue colocado en las olumnas 2ml. Una vez que el almacenador intermedio de fosfato había pasado a través de la olumna, la muestra de la proteína cruda fue cargada sobre la capota de la olumna. Una vez que la muestra había pasado a través, la olumna fue lavada con el almacenador intermedio para quitar las proteínas que eran desatadas. Esto fue verificada midiendo la absorción del almacenador intermedio que dejaba la olumna en 280nm usando un espectrofotómetro. Una vez que es limpia, la proteína encuadernada fue liberada usando el mismo almacenador intermedio, pero con la sal adicional, NAD+ o piruvato del sodio.

El proceso manejó separar la deshidrogenasa del lactato, la cinasa del piruvato y la aldolasa. Fue encontrado que los tintes 1014 y deshidrogenasa conservada 1015 del lactato, y el salto 1015 a la pectina reticulada también conservaron la cinasa del piruvato. Sin embargo, la aldolasa no fue conservada por los 10 tintes uces de los probados en este estudio.

Eliminación de las proteínas de plasma

Hay proteínas presentes en el plasma humana, que es el componente líquido de la sangre. Esto es una mezcla altamente compleja, cuyo los 75% son la albúmina de suero y la inmunoglobulina humanas G (IgG), un tipo de anticuerpo. Esto significa que esas proteínas están descubiertas muy fácilmente, pero también que podrían evitar que otras proteínas sean descubiertas. Esto podría ser problemático, pues las enfermedades diagnósticas de los marcadores con certeza podrían ser esas proteínas de la inferior-abundancia. Por lo tanto, el retiro de la albúmina de suero y de IgG es un paso crucial en la preparación del suero para los propósitos diagnósticos.

Un estudio por Urbas y el co. observaba la optimización de los métodos usados para quitar la albúmina de suero e IgG de plasma. Aquí, no sólo utilizaron la cromatografía de la pseudo-afinidad para quitar selectivamente la albúmina de suero, pero combinaron esto con cromatografía de afinidad de modo que la albúmina de suero e IgG se pudieran quitar al mismo tiempo. Mientras que esto fue encontrada para ser eficiente, el tinte mimético azul SA A6XL usado en la cromatografía de la pseudo-afinidad para quitar la albúmina de suero no era altamente específico. Por lo tanto, la capacidad de este sistema de quitar la albúmina de suero dependió de la cantidad de plasma cargada sobre la olumna. Si más plasma fue cargada sobre la olumna, la cantidad creciente de albúmina de suero podía dislocar las otras proteínas del tinte.

Fuentes

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Last Updated: Oct 29, 2018

Dr. Maho Yokoyama

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Dr. Maho Yokoyama

Dr. Maho Yokoyama is a researcher and science writer. She was awarded her Ph.D. from the University of Bath, UK, following a thesis in the field of Microbiology, where she applied functional genomics to Staphylococcus aureus . During her doctoral studies, Maho collaborated with other academics on several papers and even published some of her own work in peer-reviewed scientific journals. She also presented her work at academic conferences around the world.

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