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Pyrosequencing dans l'analyse de méthylation d'ADN

La méthylation d'ADN est une forme d'epigenetics dans laquelle l'expression du gène est encouragée ou empêchée par l'ajout d'un groupe méthylique sur des cytosines. Elle est hautement impliquée à l'étude, la différenciation cellulaire, et les cellules souche.

Pyrosequencing est une méthode d'ordonnancer-par-synthèse qui peut être appliquée pour mesurer la méthylation d'ADN aux sites de CG.

Par des dessins de LiyaCrédit d'image : Dessins de Liya/Shutterstock

Analyser la méthylation d'ADN

La méthylation d'ADN est effectuée par les méthyltransférases d'ADN, qui catalysent la réaction ajoutant un groupe méthylique au carbon-5 des cytosines. Le donneur méthylique dans cette réaction est S-adenosylmethionine (SAM), qui est un produit intermédiaire du métabolisme de la méthionine.

La méthylation d'ADN se produit type aux sites de CG. dans les mammifères, ainsi il signifie que la méthylation de cytosine se produit avant ajout à la guanine. C'est ces types de sites que pyrosequencing peut analyser.

D'autres méthodes, telles que le bisulfide ordonnançant, peuvent également analyser la méthylation d'ADN à d'autres sites. Cependant, l'ordonnancement de bisulfide et d'autres techniques telles que la CLHP et l'ACP sensible de méthylation sont plus longs, chers, et peuvent transporter des difficultés techniques.

Pyrosequencing

Pyro Sequencing

Pyrosequencing est conçu pour trouver les polymorphismes uniques de nucléotide, aussi SNP appelés. Ceux-ci peuvent être artificiellement produits aux sites méthylés de CG. par conversion de bisulfide. La demande de règlement, avec le bisulfide de sodium, convertit la cytosine en uracile.

La cytosine méthylée, cependant, est protégée contre ces conversion et restes comme cytosine. L'uracile est encore converti en thymines après l'ACP, qui a lieu après demande de règlement de bisulfide. Une amorce biotinylated unique d'ACP est comportée pour séparer deux boucles d'amplicon pour produire un amplicon échoué unique d'ADN.

Après ACP, l'amplicon échoué unique d'ACP agit en tant que matrice d'ADN pour pyrosequencing. Pyrosequencing est un ordonnancement par la méthode de synthèse, qui signifie qu'elle surveille l'ajout des nucléotides élogieux à un brin d'ADN de matrice. La cascade d'enzymes comprend l'ADN polymérase, l'ATP-SULFURYLASE, le luciferase, et l'apyrase.

Il y a deux substrats : adénosine 5' phosphosulfate, aussi aps appelés, et luciferin. Pour démarrer, une amorce de ordonnancement est recuite à la matrice échouée unique d'ADN. L'ajout d'un nucléotide unique stimule l'ADN polymérase pour comporter le dNTP (triphosphate de deoxyribonucleotide) sur la boucle, qui relâche le pyrophosphate, également PPi appelé.

PPi réagit avec des aps en présence de l'ATP-SULFURYLASE, produisant de l'ATP. Consécutivement, l'ATP réagit avec le luciferin en présence du luciferase, produisant de l'oxyluciferin, le procédé dont émet la lumière.

La lumière émise est trouvée par une caméra ccd. Les crêtes légères peuvent être comparées pour donner une mesure exacte de la quantité de méthylation en regardant l'émission légère de la constitution de C ou de T aux sites de CG. dans l'amplicon.

La lumière fournit des résultats quantitatifs utilisables qui le rend utile pour l'ADN méthylé. La réaction bioluminometric est linéaire pour l'ajout consécutif de cinq nucléotides qui sont identiques. Ceci le rend adapté pour mesurer l'abondance relative de deux différents nucléotides

Caractère pratique de pyrosequencing

Cette méthode basée par ACP a plusieurs avantages. Pour un, elle est fiable et a été appliquée pour des buts diagnostiques tels que le génotypage courant, le dépistage des mutations, et l'identification des microbes. Elle est rapide, car elle peut être complétée dans un jour si commençant par l'ACP.

Plusieurs analyses et échantillons peuvent s'analyser en même temps. Par exemple, en employant un format de 96 puits pour l'ACP, 96 analyses différentes peuvent être faites sur un échantillon, ou 96 échantillons pour une analyse.

Le moment nécessaire pour cette technique dépend du nombre de dispenses, ou des directives de séquence où des directives sont l'une des bases, exigées pour la région d'objectif. Pyrosequencing peut être appliqué aux éléments spécifiques de gène et aux estimations globales de méthylation.

Cependant, il n'est pas sans ses pièges. L'installation d'une analyse pyrosequencing peut être difficile, pendant qu'il peut être difficiles de les concevoir, et exige l'optimisation considérable. En outre, la demande de règlement de bisulfide montre pour ne pouvoir pas faire la différence entre le hydroxymethylcytosine 5 le methylcytosine (cytosine méthylée) et 5.

La réaction linéaire mentionnée ci-dessus de la réaction bioluminometric peut également avoir quelques inconvénients. Tandis qu'elle convient car elle fournit de bons résultats quantitatifs, la réaction est seulement linéaire quand les nucléotides qui sont séquentiellement ajoutés sont identiques. Si la séquence est variable et près de la homopolymère s'affiche, il ne peut facilement résoudre. Ceci peut limiter l'exactitude quantitative.

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Last Updated: Oct 18, 2018

Sara Ryding

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Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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