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Pyrosequencing nell'analisi di metilazione del DNA

La metilazione del DNA è un modulo del epigenetics in cui l'espressione genica è incoraggiata o inibita tramite l'aggiunta di un gruppo metilico sui cytosines. Altamente è implicata in via di sviluppo, la differenziazione delle cellule e le cellule staminali.

Pyrosequencing è un metodo della ordinare-da-sintesi che può applicarsi per misurare la metilazione del DNA ai siti di CG.

Dai grafici di LiyaCredito di immagine: Grafici/Shutterstock di Liya

Analizzare metilazione del DNA

La metilazione del DNA è effettuata dai methyltransferases del DNA, che catalizzano la reazione che aggiunge un gruppo metilico al carbon-5 dei cytosines. Il donatore metilico in questa reazione è S-adenosylmethionine (SAM), che è un prodotto intermedio del metabolismo di metionina.

La metilazione del DNA si presenta tipicamente ai siti di CG in mammiferi, in modo da significa che la metilazione della citosina si presenta prima dell'aggiunta a guanina. È questi tipi di siti che pyrosequencing può analizzare.

Altri metodi, quale il bisulfide che ordina, possono anche analizzare la metilazione del DNA ad altri siti. Tuttavia, l'ordinamento di bisulfide ed altre tecniche quali HPLC e la PCR sensibile di metilazione sono più che richiede tempo, costosi e possono portare le difficoltà tecniche.

Pyrosequencing

Pyro Sequencing

Pyrosequencing è destinato per trovare i singoli polimorfismi del nucleotide, anche chiamati SNPs. Questi possono essere creati artificialmente ai siti metilati di CG dalla conversione di bisulfide. Il trattamento, con il bisulfide del sodio, converte la citosina in uracile.

La citosina metilata, tuttavia, è protetta da questi conversione e resti come citosina. L'uracile più ulteriormente è convertito in timine dopo la PCR, che ha luogo dopo il trattamento di bisulfide. Una singola mano di fondo biotinylated di PCR è incorporata per separare due fili del amplicon per creare un singolo amplicon incagliato del DNA.

Dopo la PCR, il singolo amplicon incagliato di PCR funge da modello del DNA per pyrosequencing. Pyrosequencing è un ordinamento con il metodo della sintesi, che significa che riflette l'aggiunta dei nucleotidi gratuiti ad un filo del DNA del modello. La cascata degli enzimi include la DNA polimerasi, l'ATP-SOLFORILASI, il luciferase e il apyrase.

Ci sono due substrati: adenosina 5' phosphosulfate, anche chiamato APS e luciferin. Per avviarsi, una mano di fondo d'ordinamento è temprata al singolo modello incagliato del DNA. L'aggiunta di singolo nucleotide stimola la DNA polimerasi per comprendere il dNTP (trifosfato di deoxyribonucleotide) sul filo, che rilascia il pirofosfato, anche chiamato PPi.

PPi reagisce con i APS in presenza dell'ATP-SOLFORILASI, generante il trifosfato di adenosina. A sua volta, il trifosfato di adenosina reagisce con il luciferin in presenza del luciferase, generante il oxyluciferin, il trattamento di cui emette l'indicatore luminoso.

L'indicatore luminoso emesso è individuato da una telecamera CCD. I picchi leggeri possono essere confrontati per dare una misura esatta della quantità di metilazione esaminando l'emissione di luce dell'incorporazione della C o di T ai siti di CG all'interno del amplicon.

L'indicatore luminoso fornisce i risultati quantitativi utilizzabili che lo rende utile per DNA metilato. La risposta bioluminometric è lineare per l'aggiunta consecutiva di cinque nucleotidi che sono gli stessi. Ciò lo rende adatto a quantificare l'abbondanza relativa di due diversi nucleotidi

Praticità di pyrosequencing

Questo metodo basato PCR presenta parecchi vantaggi. Per uno, è affidabile ed è stato fatto domanda per gli scopi diagnostici quali genotyping sistematico, rilevazione delle mutazioni e l'identificazione dei microbi. È rapido, poichè può essere completato in un giorno se cominciando con la PCR.

Parecchi analisi e campioni possono essere analizzati allo stesso tempo. Per esempio quando usando un formato di 96 pozzi per la PCR, 96 analisi differenti possono essere fatte su un campione, o 96 campioni per un'analisi.

Il momento necessario per questa tecnica dipende dal numero delle dispense, o dalle istruzioni di sequenza dove un'istruzione è una delle basi, richieste per la regione dell'obiettivo. Pyrosequencing può applicarsi sia agli elementi specifici del gene che ai preventivi globali di metilazione.

Tuttavia, non è senza sui trabocchetti. L'installazione dell'analisi pyrosequencing può essere difficile, mentre possono essere duri da progettare e richiede l'estesa ottimizzazione. Ancora, il trattamento di bisulfide sta mostrando per non potere dire la differenza fra hydroxymethylcytosine 5 il methylcytosine (citosina metilata) e 5.

La risposta lineare suddetta della risposta bioluminometric può anche avere alcuni svantaggi. Mentre è adatto poichè fornisce i buoni risultati quantitativi, la risposta è soltanto lineare quando i nucleotidi che si aggiungono in sequenza sono identici. Se la sequenza è variabile e vicino all'omopolimere legge, non può essere facilmente risolta. Ciò può limitare l'accuratezza quantitativa.

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Last Updated: Oct 18, 2018

Sara Ryding

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Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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