Aviso: Esta página é uma tradução automática da página original em inglês. Por favor note uma vez que as traduções são geradas por máquinas, não tradução tudo será perfeita. Este site e suas páginas da Web destinam-se a ler em inglês. Qualquer tradução deste site e suas páginas da Web pode ser imprecisas e imprecisos no todo ou em parte. Esta tradução é fornecida como uma conveniência.

Pyrosequencing na análise do Methylation do ADN

O methylation do ADN é um formulário do epigenetics em que a expressão genética é incentivada ou inibida pela adição de um grupo metílico em cytosines. É implicado altamente durante o processo de desenvolvimento, a diferenciação de pilha, e as células estaminais.

Pyrosequencing é um método da arranjar em seqüência-por-síntese que possa ser aplicado para medir o methylation do ADN em locais do CG.

Por gráficos de LiyaCrédito de imagem: Gráficos de Liya/Shutterstock

Analisando o methylation do ADN

O methylation do ADN é realizado pelos methyltransferases do ADN, que catalisam a reacção que adiciona um grupo metílico ao carbon-5 dos cytosines. O doador metílico nesta reacção é S-adenosylmethionine (SAM), que é um produto intermediário do metabolismo da metionina.

O methylation do ADN ocorre tipicamente em locais do CG nos mamíferos, assim que significa que o methylation do cytosine ocorre antes da adição à guanina. É estes tipos de locais que pyrosequencing pode analisar.

Outros métodos, tais como o bisulfide que arranja em seqüência, podem igualmente analisar o methylation do ADN em outros locais. Contudo, arranjar em seqüência do bisulfide e outras técnicas tais como a HPLC e o PCR sensível do methylation são mais demorados, caros, e podem levar dificuldades técnicas.

Pyrosequencing

Pyro Sequencing

Pyrosequencing é projectado encontrar os únicos polimorfismo do nucleotide, igualmente chamados SNPs. Estes podem artificial ser criados em locais misturados do CG pela conversão do bisulfide. O tratamento, com bisulfide do sódio, converte o cytosine ao uracil.

O cytosine misturado, contudo, é protegido destas conversão e sobras como o cytosine. O Uracil é convertido mais ao thymine após o PCR, que ocorre após o tratamento do bisulfide. Uma única primeira demão biotinylated do PCR é incorporada para separar duas costas do amplicon para criar um único amplicon encalhado do ADN.

Após o PCR, o único amplicon encalhado do PCR actua como o molde do ADN para pyrosequencing. Pyrosequencing é arranjar em seqüência pelo método da síntese, que significa que monitora a adição de nucleotides elogiosos a uma costa do ADN do molde. A cascata da enzima inclui a polimerase de ADN, a ATP-SULFURILASE, o luciferase, e o apyrase.

Há duas carcaças: adenosina 5' phosphosulfate, igualmente chamado APS, e luciferin. Para começar, uma primeira demão arranjando em seqüência é recozida ao único molde encalhado do ADN. A adição de um único nucleotide spurs a polimerase de ADN para incorporar o dNTP (triphosphate do deoxyribonucleotide) na costa, que libera o pirofosfato, igualmente chamado PPi.

PPi reage com os APS na presença da ATP-SULFURILASE, gerando o ATP. Por sua vez, o ATP reage com o luciferin na presença do luciferase, gerando o oxyluciferin, o processo de que se emite a luz.

A luz emissora é detectada por uma câmera do CCD. Os picos claros podem ser comparados para dar uma medida exacta da quantidade de methylation olhando a emissão clara da incorporação de C ou de T em locais do C-G dentro do amplicon.

A luz fornece resultados quantitativos úteis que faz útil para o ADN misturado. A resposta bioluminometric é linear para uma adição consecutiva de cinco nucleotides que são os mesmos. Isto faz apropriado para determinar a abundância relativa de dois nucleotides individuais

Praticabilidade de pyrosequencing

Este método baseado PCR tem diversas vantagens. Para um, é seguro e foi aplicado para finalidades diagnósticas tais como genotyping rotineiro, detecção de mutações, e identificação dos micróbios. É rápido, porque pode ser terminado dentro de um dia se começando com PCR.

Diversos ensaios e amostras podem ser analisados ao mesmo tempo. Por exemplo, ao usar um formato de 96 poços para o PCR, 96 ensaios diferentes podem ser feitos em uma amostra, ou 96 amostras para um ensaio.

O momento necessário para esta técnica depende do número de dispensas, ou das instruções da seqüência onde uma instrução é uma das bases, exigidas para a região do alvo. Pyrosequencing pode ser aplicado aos elementos específicos do gene e às avaliações globais do methylation.

Contudo, não é sem suas armadilhas. Estabelecer um ensaio pyrosequencing pode ser difícil, enquanto podem ser duros de projectar, e exige a optimização extensiva. Além disso, o tratamento do bisulfide está mostrando para ser incapaz de dizer a diferença entre o hydroxymethylcytosine 5 o methylcytosine (cytosine misturado) e 5.

A resposta linear acima mencionada da resposta bioluminometric pode igualmente ter alguns inconvenientes. Quando for apropriado porque fornece bons resultados quantitativos, a resposta é somente linear quando os nucleotides que estão adicionados sequencialmente são idênticos. Se a seqüência é variável e perto do homopolymer lê, não se pode facilmente resolver. Isto pode limitar a precisão quantitativa.

Fontes

Further Reading

Last Updated: Oct 18, 2018

Sara Ryding

Written by

Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

Citations

Please use one of the following formats to cite this article in your essay, paper or report:

  • APA

    Ryding, Sara. (2018, October 18). Pyrosequencing na análise do Methylation do ADN. News-Medical. Retrieved on September 18, 2021 from https://www.news-medical.net/life-sciences/Pyrosequencing-in-DNA-Methylation-Analysis.aspx.

  • MLA

    Ryding, Sara. "Pyrosequencing na análise do Methylation do ADN". News-Medical. 18 September 2021. <https://www.news-medical.net/life-sciences/Pyrosequencing-in-DNA-Methylation-Analysis.aspx>.

  • Chicago

    Ryding, Sara. "Pyrosequencing na análise do Methylation do ADN". News-Medical. https://www.news-medical.net/life-sciences/Pyrosequencing-in-DNA-Methylation-Analysis.aspx. (accessed September 18, 2021).

  • Harvard

    Ryding, Sara. 2018. Pyrosequencing na análise do Methylation do ADN. News-Medical, viewed 18 September 2021, https://www.news-medical.net/life-sciences/Pyrosequencing-in-DNA-Methylation-Analysis.aspx.

Comments

The opinions expressed here are the views of the writer and do not necessarily reflect the views and opinions of News Medical.