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Pyrosequencing en análisis de la metilación de la DNA

La metilación de la DNA es una forma del epigenetics en la cual la expresión génica es animada o inhibida por la adición de un grupo metílico en cytosines. Se implica altamente en el revelado, la diferenciación de célula, y células madres.

Pyrosequencing es un método de la ordenar-por-síntesis que se puede aplicar para medir la metilación de la DNA en los sitios del CG.

Por los gráficos de LiyaHaber de imagen: Gráficos/Shutterstock de Liya

Analizar la metilación de la DNA

La metilación de la DNA es realizada por los methyltransferases de la DNA, que catalizan la reacción que agrega a un grupo metílico al carbon-5 de cytosines. El donante metílico en esta reacción es S-adenosylmethionine (SAM), que es un producto intermedio del metabolismo de la metionina.

La metilación de la DNA ocurre típicamente en los sitios del CG en mamíferos, así que significa que la metilación de la citosina ocurre antes de la adición a la guanina. Es estos tipos de sitios que el pyrosequencing pueda analizar.

Otros métodos, tales como bisulfide que ordena, pueden también analizar la metilación de la DNA en otros sitios. Sin embargo, la secuencia del bisulfide y otras técnicas tales como CLAR y polimerización en cadena sensible de la metilación son más que toma tiempo, costosas, y pueden llevar dificultades técnicas.

Pyrosequencing

Pyro Sequencing

Pyrosequencing se diseña para encontrar los únicos polimorfismos del nucleótido, también llamados SNPs. Éstos se pueden crear artificial en los sitios desnaturalizados del CG por la conversión del bisulfide. El tratamiento, con bisulfide del sodio, convierte la citosina al uracilo.

La citosina desnaturalizada, sin embargo, se protege contra esta conversión y permanece como citosina. El uracilo se convierte más a fondo al thymine después de la polimerización en cadena, que ocurre después del tratamiento del bisulfide. Una única pintura de fondo biotinylated de la polimerización en cadena se incorpora para separar dos cabos del amplicon para crear un único amplicon trenzado de la DNA.

Después de la polimerización en cadena, el único amplicon trenzado de la polimerización en cadena actúa como el patrón de la DNA para pyrosequencing. Pyrosequencing es una secuencia por el método de la síntesis, que significa que vigila la adición de nucleótidos elogiosos a un cabo de la DNA del patrón. La cascada de la enzima incluye la polimerasa de DNA, la ATP-SULFURILASA, el luciferase, y el apyrase.

Hay dos substratos: adenosina 5' phosphosulfate, también llamado APS, y luciferin. Para comenzar, una pintura de fondo de secuencia se destempla al único patrón trenzado de la DNA. La adición de un único nucleótido estimula la polimerasa de DNA para incorporar el dNTP (trifosfato del deoxyribonucleotide) en el cabo, que libera el pirofosfato, también llamado PPi.

PPi reacciona con los APS en presencia de la ATP-SULFURILASA, generando el ATP. A su vez, el ATP reacciona con luciferin en presencia del luciferase, generando oxyluciferin, el proceso cuyo emite la luz.

La luz emitida es descubierta por una cámara CCD. Los picos livianos se pueden comparar para dar una medición exacta de la cantidad de metilación observando la emisión liviana de la incorporación de C o de T en los sitios del CG dentro del amplicon.

La luz ofrece resultados cuantitativos usables que hace útil para la DNA desnaturalizada. La reacción bioluminometric es lineal para la adición consecutiva de cinco nucleótidos que sean lo mismo. Esto hace conveniente para cuantificar la abundancia relativa de dos nucleótidos individuales

Sentido práctico de pyrosequencing

Este método basado polimerización en cadena tiene varias ventajas. Para uno, es seguro y se ha solicitado propósitos diagnósticos tales como genotyping rutinario, detección de mutaciones, e identificación de microbios. Es rápido, pues puede ser terminado dentro de un día si comienza con la polimerización en cadena.

Varios análisis y muestras se pueden analizar al mismo tiempo. Por ejemplo, al usar un formato de 96 pozos para la polimerización en cadena, 96 diversos análisis se pueden hacer en una muestra, o 96 muestras para un análisis.

La época necesaria para esta técnica depende del número de dispensaciones, o de las instrucciones de la serie donde está una una instrucción de las bases, requeridas para la región del objetivo. Pyrosequencing se puede aplicar a los elementos específicos del gen y a los presupuestos globales de la metilación.

Sin embargo, no está sin sus trampas. Fijar un análisis pyrosequencing puede ser difícil, mientras que pueden ser duras de diseñar, y requiere la optimización extensa. Además, el tratamiento del bisulfide está mostrando para no poder informar la diferencia entre el hydroxymethylcytosine 5 el methylcytosine (citosina desnaturalizada) y 5.

La reacción lineal ya mencionada de la reacción bioluminometric puede también tener algunas desventajas. Mientras que es conveniente pues ofrece buenos resultados cuantitativos, la reacción es solamente lineal cuando los nucleótidos que se agregan secuencialmente son idénticos. Si la serie es variable y cerca del homopolímero lee, puede no ser fácilmente resuelta. Esto puede limitar la exactitud cuantitativa.

Fuentes

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Last Updated: Oct 18, 2018

Sara Ryding

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Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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