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Diminuzione dell'inibizione di PCR in scienza legale

Ci sono parecchie molecole che possono degradare il DNA ed interferire con la reazione di PCR. Gli inibitori di PCR possono legare alla DNA polimerasi, interagire con DNA stesso, o interagire con la DNA polimerasi durante l'estensione della mano di fondo.

Maschera dello scienziato che colloca il tubo di PCR con la polimerasi di Taq nel commputer di PCR - catturato da Putita

Putita | Shutterstock

Inibitori della DNA polimerasi

Il rapporto di proteina e di DNA è molto asimmetrico nel sangue umano; per ogni 1µl di sangue, c'è circa 35ng di proteina, che può interferire con il trattamento di polimerizzazione. Il Heme, una componente di emoglobina, egualmente è stato indicato per inibire la PCR. Ciò è dovuto la versione degli ioni del ferro, che pregiudicano il pH della reazione ed interrompe l'attività della polimerasi, la sonda e le mani di fondo. Per questo motivo, il heme è considerare spesso come un inibitore universale di PCR.

Ampiamente è stato osservato che l'emoglobina interrompe la PCR dopo la disintegrazione dalla proteinasi K, mentre non c'è effetto da emoglobina non digerita. La melanina è un altro melabolite conosciuto per inibire la polimerasi di Taq. Aumentando la concentrazione per le polimerasi di Taq è stato proposto per gli acidi umici che inibiscono la PCR.

Inibitori dell'acido dei nuclei

Gli acidi nucleici inibiscono la ricottura o l'estensione della mano di fondo e così, pregiudichi il punto di fusione o la conformazione di DNA. L'immunoglobulina G (IgG) è stata trovata per formare un complesso con singolo DNA incagliato e per inibire la PCR. È stato trovato che sebbene la polimerasi di Taq, Ampli Taq, Pwo non potesse ampliare il DNA in presenza di IgG, l'enzima di Tth ancora può.

Inibitori di fluorescenza

Nella PCR in tempo reale, gli inibitori che possono pregiudicare il segnale della fluorescenza sono presenti. Ciò è dovuto i cambiamenti nella concentrazione nello ione, o l'associazione e l'estinzione dei fluorophores. Gli acidi umici sequestrano il bromuro di etidio e diminuiscono l'interazione del DNA. Questo effetto aumenta con aumento nella lunghezza del tubo e nel volume più basso, in modo da quel la grande cura dovrebbe essere catturata con quei fattori.

Buffer di PCR

BSA è un agevolatore comune di PCR. Può legare agli acidi grassi e le molecole organiche e questa abilità obbligatoria possono diminuire l'inibizione durante l'amplificazione in vitro. Può anche legare agli inibitori, quali heme e melanina ed impedirle l'associazione alla DNA polimerasi.

In presenza di BSA, gli inibitori quali i fenoli legano a BSA invece della polimerasi. Le concentrazioni differenti di BSA sono state provate per diminuire l'effetto di inibizione.

Oltre a BSA, i detersivi inorganici, quali Tween 20 e tritone X egualmente sono usati per facilitare il punto di amplificazione. Fra i solventi organici, DMSO e la formammide sono usati per diminuire l'inibizione. I soluti biologicamente compatibili, quali betaina e glicerolo e polimeri, compreso la PARITÀ ed il dextrano sono usati spesso.

Metodi di campionamento che pregiudicano l'affidabilità di PCR

I buoni metodi di campionamento possono anche diminuire gli effetti di inibizione di PCR. Durante l'analisi legale del DNA, la dimensione del DNA del campione può essere molto piccola e può una presenza di alto sfondo, per esempio acque reflue. A questo fine, il campionamento diretto, in cui il materiale direttamente è collocato nel tubo del trattamento per aumentare il numero delle cellule bersaglio, è usato.

Il tamponamento di superficie può anche essere usato per diminuire i livelli di inibitori di PCR che possono essere presenti nel substrato. I tamponi possono anche essere inumiditi facendo uso di salino per migliorare il ripristino delle cellule. I tamponi di nylon possono anche essere utilizzati per aumentare il numero delle cellule.

Trattamento Pre-PCR

Gli inibitori alla PCR possono entrare ai punti differenti della trattamento-campionatura di PCR, del trattamento del campione e della PCR. Ciò può essere diminuita usando le DNA polimerasi che sono agevolatori di PCR e termostabili. Il trattamento Pre-PCR permette che i campioni con alta precisione analitica siano generati.

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Last Updated: Dec 17, 2018

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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