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Reduzindo a inibição do PCR na ciência forense

Há diversas moléculas que podem degradar o ADN e interferir com a reacção do PCR. Os inibidores do PCR podem ligar à polimerase de ADN, interagir com o ADN próprio, ou interagir com a polimerase de ADN durante a extensão da primeira demão.

Imagem do cientista que coloca a câmara de ar do PCR com a polimerase de Taq na máquina do PCR - tomada por Putita

Putita | Shutterstock

Inibidores da polimerase de ADN

A relação da proteína e do ADN é enviesada altamente no sangue humano; para cada 1µl do sangue, há sobre 35ng da proteína, que pode interferir com o processo da polimerização. O Heme, um componente da hemoglobina, foi mostrado igualmente para inibir o PCR. Isto é devido à liberação dos íons do ferro, que afectam o pH da reacção, e interrompe a actividade da polimerase, a ponta de prova e as primeiras demão. Por este motivo, o heme é considerado frequentemente como um inibidor universal do PCR.

Observou-se extensamente que a hemoglobina interrompe o PCR após a desintegração pela protease K, quando não houver nenhum efeito da hemoglobina não-digerida. A melanina é um outro melabolite conhecido para inibir a polimerase de Taq. Aumentar a concentração para polimerases de Taq foi propor para os ácidos humic que inibem o PCR.

Inibidores do ácido dos núcleos

Os ácidos nucleicos inibem o recozimento ou a extensão da primeira demão, e assim, afecte o ponto de derretimento ou a conformação do ADN. A imunoglobulina G (IgG) foi encontrada para formar um complexo com único ADN encalhado e para inibir o PCR. Encontrou-se que embora a polimerase de Taq, Ampli Taq, Pwo não pudesse amplificar o ADN na presença de IgG, a enzima de Tth ainda pode.

Inibidores da fluorescência

No PCR do tempo real, os inibidores que podem afectar o sinal da fluorescência estam presente. Isto é devido às mudanças na concentração do íon, ou o emperramento e extinguir dos fluorophores. Os ácidos Humic confiscam o brometo de ethidium e reduzem a interacção do ADN. Este efeito aumenta com aumento no comprimento da câmara de ar e em um mais baixo volume, assim que aquele grande deve ser tomado com aqueles factores.

Amortecedores do PCR

BSA é um facilitador comum do PCR. Pode ligar aos ácidos gordos e as moléculas orgânicas e esta capacidade obrigatória podem reduzir a inibição durante in vitro a amplificação. Pode igualmente ligar aos inibidores, tais como o heme e a melanina e impedir que liguem à polimerase de ADN.

Na presença de BSA, os inibidores tais como fenóis ligam a BSA em vez da polimerase. As concentrações diferentes de BSA foram testadas para reduzir o efeito da inibição.

Independentemente de BSA, os detergentes inorgánicos, tais como o tween 20 e o triton X são usados igualmente para facilitar a etapa da amplificação. Entre solventes orgânicos, DMSO e o formamide são usados para reduzir a inibição. Os solutes biològica compatíveis, tais como a betaína e o glicerol, e os polímeros, incluindo o PEG e o dextrano são usados frequentemente.

Métodos de amostra que afectam a confiança do PCR

Os bons métodos de amostra podem igualmente reduzir os efeitos da inibição do PCR. Durante a análise judicial do ADN, o tamanho do ADN da amostra pode ser muito pequeno, e pode uma presença de fundo alto, por exemplo águas residuais. Com esta finalidade, a amostra directa, onde o material é colocado directamente na câmara de ar do tratamento para aumentar o número de pilhas de alvo, é usada.

A limpeza de superfície pode igualmente ser usada para reduzir os níveis de inibidores do PCR que podem estam presente na carcaça. Os cotonetes podem igualmente ser utilização umedecida salina para melhorar a recuperação da pilha. Os cotonetes de nylon podem igualmente ser usados para aumentar o número da pilha.

Processamento Pre-PCR

Os inibidores ao PCR podem entrar em etapas diferentes da processo-amostra do PCR, do tratamento da amostra e do PCR. Isto pode ser reduzido usando as polimerases de ADN que são calor - estábulo e facilitadores do PCR. Processar Pre-PCR permite que as amostras com precisão analítica alta sejam geradas.

Fontes:

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Last Updated: Dec 17, 2018

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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