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Reducir la inhibición de la polimerización en cadena en ciencia forense

Hay varias moléculas que pueden degradar la DNA e interferir con la reacción de la polimerización en cadena. Los inhibidores de la polimerización en cadena pueden atar a la polimerasa de DNA, obrar recíprocamente con la DNA sí mismo, u obrar recíprocamente con la polimerasa de DNA durante la extensión de la pintura de fondo.

Retrato del científico que coloca el tubo de la polimerización en cadena con la polimerasa de Taq en la máquina de la polimerización en cadena - tomada por Putita

Putita | Shutterstock

Inhibidores de la polimerasa de DNA

La índice de la proteína y de la DNA se sesga altamente en sangre humana; para cada 1µl de la sangre, hay sobre 35ng de la proteína, que puede interferir con el proceso de la polimerización. El Heme, un componente de la hemoglobina, también se ha mostrado para inhibir la polimerización en cadena. Esto es debido a la baja de los iones del hierro, que afectan al pH de la reacción, y rompe la actividad de la polimerasa, la antena y las pinturas de fondo. Por este motivo, el heme se mira a menudo como inhibidor universal de la polimerización en cadena.

Se ha observado extensamente que la hemoglobina rompe la polimerización en cadena después de ser desintegrado por la proteinasa K, mientras que no hay efecto de la hemoglobina no-digerida. La melanina es otro melabolite sabido para inhibir la polimerasa de Taq. El aumento de la concentración para las polimerasas de Taq se ha propuesto para los ácidos húmicos que inhiben la polimerización en cadena.

Inhibidores del ácido de los núcleos

Los ácidos nucléicos inhiben la esmaltación o la extensión de la pintura de fondo, y así, afecte al punto de fusión o a la conformación de la DNA. La inmunoglobulina G (IgG) fue encontrada para formar un complejo con la única DNA trenzada y para inhibir la polimerización en cadena. Se ha encontrado que aunque la polimerasa de Taq, Ampli Taq, Pwo no pueda amplificar la DNA en presencia de IgG, todavía puede la enzima de Tth.

Inhibidores de la fluorescencia

En la polimerización en cadena en tiempo real, los inhibidores que pueden afectar a la señal de la fluorescencia están presentes. Esto es debido a los cambios en la concentración del ión, o el atascamiento y el enfriamiento de fluorophores. Los ácidos húmicos secuestran el bromuro de etidio y reducen la acción recíproca de la DNA. Este efecto aumenta con aumento en largo del tubo y un volumen más bajo, así que eso el gran cuidado se debe tomar con esos factores.

Almacenadores intermedios de la polimerización en cadena

BSA es un facilitador común de la polimerización en cadena. Puede atar a los ácidos grasos y las moléculas orgánicas y esta capacidad obligatoria pueden reducir la inhibición durante la amplificación in vitro. Puede también atar a los inhibidores, tales como heme y melanina y evitar que aten a la polimerasa de DNA.

En presencia de BSA, los inhibidores tales como fenoles atan a BSA en vez de la polimerasa. Diversas concentraciones de BSA se han probado para reducir el efecto de la inhibición.

Aparte de BSA, los detersorios inorgánicos, tales como tween 20 y tritón X también se utilizan para facilitar el paso de la amplificación. Entre disolventes orgánicos, DMSO y la formamida se utilizan para reducir la inhibición. Los solutos biológico compatibles, tales como betaína y glicerol, y los polímeros, incluyendo ESPIGA y el dextrano son de uso frecuente.

Métodos de muestreo que afectan a confiabilidad de la polimerización en cadena

Los buenos métodos de muestreo pueden también reducir los efectos de la inhibición de la polimerización en cadena. Durante análisis forense de la DNA, la talla de la DNA de la muestra puede ser muy pequeña, y puede una presencia de alto fondo, por ejemplo aguas residuales. Con este fin, se utiliza el muestreo directo, donde el material se pone directamente en el tubo del tratamiento para aumentar el número de células de objetivo.

El limpiar superficial se puede también utilizar para reducir los niveles de inhibidores de la polimerización en cadena que puedan estar presentes en el substrato. Los lampazos se pueden también humedecer usando salino para perfeccionar la recuperación de la célula. Los lampazos de nylon se pueden también utilizar para aumentar el número de la célula.

Tramitación Pre-POLIMERIZACIÓN EN CADENA

Los inhibidores a la polimerización en cadena pueden entrar en diversos pasos del proceso-muestreo de la polimerización en cadena, del tratamiento de la muestra y de la polimerización en cadena. Esto se puede reducir usando las polimerasas de DNA que son facilitadores termoestables y de la polimerización en cadena. El tramitación Pre-POLIMERIZACIÓN EN CADENA permite que las muestras con la alta precisión analítica sean generadas.

Fuentes:

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Last Updated: Dec 17, 2018

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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