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Technique de polymorphisme de longueur d'éclat (RFLP) de restriction

Le polymorphisme de longueur d'éclat de restriction (RFLP) est une technique inventée en 1984 par le scientifique anglais Alec Jeffreys pendant la recherche dans des maladies héréditaires. Il est employé pour l'analyse de seules configurations dans les fragments d'ADN afin de différencier génétiquement entre les organismes - ces configurations sont Variable Number appelé des séquences répétées en tandem (VNTRs).

Le polymorphisme génétique est défini comme différences génétiques héritées parmi des personnes dans plus de 1% de population normale. La technique de PLFR exploite ces différences dans les séquences d'ADN pour identifier et étudier la variation intraspecies et interspecies.

Polymorphisme de longueur d
Polymorphisme de longueur d'éclat de restriction (RFLP)

Principe

Les endonucléases de restriction sont des enzymes qui coupent l'ADN prolongé en pièces courtes. Chaque endonucléase de restriction vise différentes séquences de nucléotides dans un brin d'ADN et coupe pour cette raison à différents sites.

La distance entre les sites de clivage d'une certaine endonucléase de restriction diffère entre les personnes. Par conséquent, la longueur des fragments d'ADN produits par une endonucléase de restriction différera en travers des deux différents organismes et substances.

Comment fonctionne-t-cela ?

Le PLFR est exécuté utilisant une suite d'opérations brièvement données ci-dessous :

Extraction d'ADN

Pour commencer par, l'ADN est extrait du sang, de la salive ou d'autres échantillons et épuré.

Fragmentation d'ADN

L'ADN épuré est assimilé utilisant des endonucléases de restriction. Les sites de reconnaissance de ces enzymes sont généralement 4 à 6 paires de bases de longueur. Plus la séquence identifiée est courte, plus le nombre d'éclats produits de la digestion est grand.

Par exemple, s'il y a une courte séquence de GAGC qui se produit à plusieurs reprises dans un échantillon d'ADN. L'endonucléase de restriction qui identifie la séquence de GAGC coupe l'ADN à chaque répétition de la configuration de GAGC.

Si un échantillon répète la séquence de GAGC 4 fois tandis qu'un autre échantillon la répète 2 fois, la longueur des éclats produits par l'enzyme pour les deux échantillons sera différente.

Électrophorèse en gel

Les éclats de restriction produits pendant la fragmentation d'ADN s'analysent utilisant l'électrophorèse en gel.

Les éclats sont négativement - chargé et peuvent être facilement séparés par l'électrophorèse, qui sépare des molécules basées sur leur taille et charge. Les échantillons réduits en fragments d'ADN sont mis dans la chambre contenant le gel électrophorétique et deux électrodes.

Quand un champ électrique est appliqué, les éclats émigrent vers l'électrode positive. De plus petits éclats déménagent plus rapidement par le gel partant les plus grands derrière et les échantillons d'ADN sont séparés ainsi dans les bandes distinctes sur le gel.

Visualisation des bandes

Le gel est traité avec les teintures luminescentes afin de rendre les bandes d'ADN visibles.

Applications de PLFR

Le PLFR a été employé pour plusieurs applications d'analyse génétique depuis son invention.

Certaines de ces derniers introduisent des applications de PLFR sont cotées ci-dessous :

  • Pour déterminer le statut de maladies génétiques telles que la mucoviscidose dans une personne.
  • Pour déterminer ou confirmer la source d'un échantillon d'ADN comme dans des tests ou des enquêtes criminelles de paternité.
  • Dans le mappage génétique pour déterminer les régimes de recombinaison qui montrent la distance génétique entre les lieux.
  • Pour recenser un transporteur d'une mutation de pathogène dans une famille.

Désavantages de PLFR

Depuis son invention, le PLFR a été des techniques très utilisées d'une analyse de génome utilisées en science légale, médicament, et études génétiques. Cependant, il est devenu presque périmé avec l'arrivée de l'ADN relativement simple et moins cher profilant des technologies telles que l'amplification en chaîne par polymérase (PCR).

La procédure de PLFR exige de nombreuses opérations et prend des semaines aux résultats de puissance, alors que les techniques telles que l'ACP peuvent amplifier des séquences d'ADN d'objectif dans un simple peu d'heures.

Supplémentaire, le PLFR exige un grand échantillon d'ADN, l'isolement dont peut être un procédé laborieux et long. En revanche, l'ACP peut amplifier des quantités minutieuses d'ADN en quelques heures.

En raison de nombreuses raisons de ce type, la technique d'ACP a en grande partie remonté le PLFR dans la plupart des applications exigeant l'ADN ordonnançant comme le contrôle de paternité ou l'analyse légale d'échantillon.

En outre, l'identification des polymorphismes d'unique-nucléotide dans le projet génome humain a presque remonté le besoin de PLFR dans l'analyse d'état de la maladie.

Références

Further Reading

Last Updated: Jun 26, 2019

Susha Cheriyedath

Written by

Susha Cheriyedath

Susha has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Chemistry and Master of Science (M.Sc) degree in Biochemistry from the University of Calicut, India. She always had a keen interest in medical and health science. As part of her masters degree, she specialized in Biochemistry, with an emphasis on Microbiology, Physiology, Biotechnology, and Nutrition. In her spare time, she loves to cook up a storm in the kitchen with her super-messy baking experiments.

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    Cheriyedath, Susha. (2019, June 26). Technique de polymorphisme de longueur d'éclat (RFLP) de restriction. News-Medical. Retrieved on September 20, 2021 from https://www.news-medical.net/life-sciences/Restriction-Fragment-Length-Polymorphism-(RFLP)-Technique.aspx.

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Comments

  1. Rachael Bartram Rachael Bartram Australia says:

    when saying "For example, if there is a short sequence of GAGC that occurs repeatedly in a sample of DNA. The restriction endonuclease that recognizes the GAGC sequence cuts the DNA at every repetition of the GAGC pattern." what is GAGC?

  2. Satyajeet Khare Satyajeet Khare India says:

    I see a 1980 paper Botstein et al, AJMG which mentions RFLP.

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